EXTRACTION DE L’ADN GENOMIQUE DES CELLULES

La détermination du polymorphisme du gène VDR nécessite au préalable l’extraction des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) ou peripheric blood mononuclear cells (PBMC). Ce qui est suivie de l’extraction de leur ADN génomique, de l’amplification des séquences d’ADN d’intérêt du gène VDR [l’exon 2 (Fok-1), de l’intron 8 (Bsm-1), de l’intron 8 (Apa-1) et de l’exon 9 (Taq-1)] et de leur séquençage.

III.6.1. Extraction des cellules mononucléées

L’extraction des cellules mononucléées a nécessité la séparation des cellules sanguines selon leur gradient de densité grâce à la solution de gradient Ficoll ou milieu de séparation des lymphocytes (MSL) à base de Ficoll. Ainsi, les éléments figurés du sang, déposés sur une solution de Ficoll de haute densité, ont subi durant une centrifugation, une migration différentielle qui conduit à leur séparation en fonction de la densité. Après une centrifugation, les érythrocytes et les granulocytes ont sédimenté au fond du tube et les cellules mononuclées ont formé un anneau à l’interface entre le plasma et le ficoll (Janoly-Dumenil, 2008 ;

Baskara-Yhuellou, 2013) (Annexe 15).

Dans un tube conique propre de 17 x 100 mm contenant 4 mL de tampon phosphate « PBS » (Phosphate Buffer Saline), 4 mL de sang total ont été ajoutés. Le mélange obtenu est coulé délicatement sur un volume de 7 mL de solution de gradient Ficoll. Le tout est centrifugé pendant 15 min à 2 200 trs/min.

K = 0,56

0, 5 x 52305

K =

83 La totalité de l'anneau central blanc (contenant les lymphocytes et les monocytes) est prélevée, puis déposée dans un nouveau tube à centrifuger stérile de 15 mL. Un volume de 6 à 10 mL de RPMI-1640 [nitrate de calcium (NaHCO3, 2 g/L) sans L-Glutamine] est ajouté selon la présence apparente en Ficoll. L’ensemble est centrifugé à nouveau pendant 10 min à 1 500 trs/min. Puis après élimination du surnageant le culot cellulaire contenant les cellules mononuclées est récupéré pour être lavé.

 Lavage des cellules mononucléaires

Le culot cellulaire obtenu est suspendu dans un volume de 2 à 3 mL de RPMI-1640 et centrifugé pendant 10 min à 1 500 trs/min. Le surnageant est éliminé et le sédiment cellulaire est suspendu à nouveau dans 2 mL de milieu complet[RPM1-1640 + 1 % de L-glutamine 2mM + 1 % acide aminé non essentiel (AANE) 100 mM + 1 % HEPES 10 mM + 1 % sodium pyruvate 1 mM + 1 % pénicilline (50 U/mL) / streptomycine (50 μg/mL)] supplémenté de sérum (10 % SVF) et l’ensemble est centrifugé pendant 10 min à 1 500 trs/min.

 Cryoconservation des cellules mononucléaires

Les cellules mononucléaires sont introduites dans 1 mL de milieu approprié contenant 70 % milieu complet avec 20 % SVF + 10 % DMSO. L’ensemble est congelé dans de l’azote liquide puis conservé à – 80 °C.

 Protocole de décongélation

Les CMSP préalablement congelées sont traitées selon la méthode de Janoly-Dumenil

(2008). Elles sont rapidement décongelées au bain-marie à 37 °C. Puis, le sédiment cellulaire

est dilué avec un volume approprié du même milieu complet supplémenté de sérum. L’ensemble est laissé au repos pendant 5 min, puis centrifugé pendant 5 min à 12 000 trs/min. Le surnageant contenant le reste de DMSO est éliminé. Un volume de 1 mL de suspension cellulaire, ainsi obtenu, est transféré dans 1 mL de milieu complet avec 20 % SVF. Un aliquote de 200 µL est ensuite prélevé pour l’extraction de l’ADN.

III.6.2. Extraction de l’ADN génomique au kit QIAGEN

L’extraction de l’ADN génomique humain a été réalisée en utilisant le kit commercial «Qiagen».

Les tampons de lyse (TL), de lavage 1 (AWl), de lavage 2 (AW2), d’élution (AE) nécessaires et les colonnes d'extraction ont donc été préparés à l'avance selon les indications du fabriquant.

84 Après avoir suivi les procédures de décongélation des CMSP, la suspension cellulaire a été ramenée à température ambiante. Un volume de 200 µL de suspension lymphocytaire (5.106

cellules de lymphocytes) a été mis dans un tube de lyse (LT), puis un volume de 200 μL de tampon de lyse (AL) a été ajouté à la suspension cellulaire. Le tout a été homogénéisé au vortex pendant 15 sec et un volume de 20 μL de protéinase K (QP) a été transféré dans le tube de lyse (LT). Après homogénéisation (15 sec) et incubation (10 min à 56 °C), tout le lysat a été transféré délicatement dans une colonne Qiagen.

Un volume de 200 µL d'éthanol 96 °C a été introduit dans la colonne Qiagen et l’ensemble a été centrifugé à 8 000 trs/min pendant 1 min. La colonne a été ensuite placée dans un nouveau tube de lavage (WT). Le tube contenant le filtrat est mis au rebut. Un volume de 500 µL de tampon de lavage 1 (AWl) a été ajouté à la colonne qui après centrifugation à 8 000 trs/min pendant 1 min, a été ensuite placée dans un nouveau tube de lavage (WT). Le tube contenant le filtrat a été mis au rebut. Un volume de 500 µL de tampon de lavage 2 (AW2) a été introduit dans la colonne. Puis après centrifugation à 14 000 trs/min pendant 3 min, la colonne a été placée dans un nouveau tube de lavage (WT). Le tube contenant le filtrat a été mis au rebut. La colonne a été placée dans un nouveau tube de lavage (WT) et centrifugée à 14 000 trs/min pendant 3 min, ce qui a permis d’éliminer toutes les traces de tampon de lavage. Pour décrocher l’ADN, la colonne a été placée dans un nouveau tube d’élution (ET). Un volume de 200 μL de tampon d’élution (AE) a été déposé au centre de la membrane et le tout est incubé à température ambiante (15 à 25 °C) pendant 1 min et centrifugé pendant 1 min à environ 8 000 trs/min afin d’éluer l’ADN de la membrane et le récupérer dans le tube eppendorf de 1,5 mL. L’ADN a été conservé à -20 °C pour permettre son utilisation dans la réaction d’amplication.

 Préparation du gel d'agarose

Une masse de 0,7 g d'agarose a été pesée et mis dans un erlenmeyer. Cent µL de tampon TBE (40 mM Tris-Borate, 1 mM EDTA) y ont été ajoutés, puis le mélange obtenu a été agité et fondu par chauffage (100 °C) dans une micro-onde (Annexe 16) pendant 3 min. Un volume de 1 µL de SYBR® green I a été ajouté à la solution et l’ensemble a été refroidi jusqu’à 65 °C. Le gel obtenu a été coulé dans un moule (plateau de coulée) (Annexe 17) contenant un plateau de gel et un peigne à 16 dents pour créer des puits. L’ensemble a été laissé à la température ambiante jusqu’à la solidification du gel.

 Migration et visualisation sur le gel d’agarose

Pour la migration, un volume de 5 µL d’un marqueur de poids moléculaire Smart Ladder 100 bp (Eurogentec, France) a été déposé dans le puits 1. De même, un volume de 10 µL d’ADN combiné au préalable au tampon de charge (5 µL) a été déposé dans le puits. Chaque puits

85 correspond à un échantillon différent. Les bandes de l’électrophorèse sont révélées à la lumière UV après 20 min de migration à 135 V (lampe à vapeur de mercure λ= 312 nm) dans la cuve de migration (Annexe 18) grâce au marquage au SYBR® green I qui s’intercale entrée les bases de la molécule d’ADN bicaténaire. Ce marquage crée une fluorescence de couleur orangée en présence de rayonnement UV (Fan et Margaret, 2001).