A formação de uma estrutura porosa é uma das principais metas na fabricação de scaffolds. Estruturas porosas são criadas quando partículas ou bolhas são introduzidas enquanto o scaffold se solidifica, sendo posteriormente removidas, gerando uma rede interconectada de poros (SARKAR et al., 2013). A maioria das técnicas de fabricação de scaffolds porosos, incluindo lixiviação de partículas, liofilização, infusão de gás, e separação de fases, criam poros interconectados distribuídos isotopicamente (SARKAR et al., 2013).
A liofilização é um dos métodos mais comumente utilizados para a produção de poros em scaffolds (KUCHARSKA et al., 2008). Entretanto, trata-se de um método oneroso, trabalhoso e de difícil escalonamento (BUENO; MORAES, 2011). Desta forma, outras estratégias para a elaboração de scaffolds porosos são de grande interesse, como através da adição de tensoativos como Tween 80 e Pluronic F-68 à mistura reacional dos polissacarídeos (BUENO; MORAES, 2011). A adição de tensoativos a polímeros também é muitas vezes realizada para promover homogeneização, emulsificação, suspensão, controle da reologia e melhora da estabilidade coloidal (HOLMBERG et al., 2002).
de surfactantes não-iônicos, considerados menos prejudiciais, e usados como aditivo em formulações cosméticas e no preparo de emulsões tópicas (ZHANG et al., 2003). Sendo assim, o Poloxamer 188 foi selecionado para o desenvolvimento deste trabalho e será mais detalhadamente descrito a seguir.
2.3.5.1 Poloxamer 188
Poloxamers são copolímeros sintéticos compostos por três blocos: uma cadeia central hidrofóbica de poli(oxi propileno) (PPO) e duas cadeias laterais hidrofílicas de poli(oxi etileno) (PEO), conforme demonstrado na Figura 14.
Figura 14 – Estrutura química típica de poloxamers: PEO definido por polioxietileno e PPO definido por polioxipropileno (adaptada de SANTANDER-ORTEGA et al., 2006).
Este arranjo resulta em uma estrutura anfifílica, sendo sua massa molar, hidrofilicidade e hidrofobicidade variáveis através da alteração do número de cadeias laterais da molécula. Uma enorme variedade de poloxamers teve sua fabricação iniciada nos anos 50 e disponibilizada comercialmente pela empresa BASF Corporation, com o nome comercial de Pluronic® (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
O Poloxamer 188 (P188), além de ser também conhecido como Pluronic® F-68, é denominado comercialmente como Kolliphor® P188 (Sigma-Aldrich), FlocorTM (CytRx Corporation), RheothRx (Glaxo Wellcome Inc.), Lutrol® (Basf) e Synperonic F-68 (Croda), sendo um copolímero linear com massa molar de aproximadamente 8400 Daltons, contendo cerca de 80% de poli(oxi etileno) e 20% de poli(oxi propileno). Este surfactante é um excipiente aprovado pela FDA há cerca de 50 anos, sendo solúvel tanto em água quanto em solventes orgânicos diversos, muito utilizado em dispersões sólidas para melhorar a solubilidade de fármacos (MA; SONG, 2007).
Em estudos clínicos de fase I, o Poloxamer 188 mostrou uma meia-vida de 18 horas e
demonstra ser seguro em períodos de exposição por infusão superiores a 72 horas em doses a partir de 30 mg de Poloxamer 188 por quilograma do paciente por hora (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012). É bem tolerado em exposições repetidas e é comumente utilizado em diversos produtos, como pasta de dente, laxantes e enxaguantes bucais. Suas propriedades fazem deste copolímero um composto muito útil em aplicações cosméticas e farmacêuticas (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
A característica mais bem documentada do P188 é sua habilidade de reparar membranas celulares degradadas através de mecanismos que ainda não foram totalmente elucidados. O surfactante pode agir aumentando o empacotamento lipídico, pois se acredita que ele é incorporado diretamente na bicamada lipídica, sendo o processo modulado pela tensão superficial da membrana, como demonstrado em alguns estudos in vitro utilizando monocamadas lipídicas (MOLOUGHNEY; WEISLEDER, 2012).
Além de apresentar características crioprotetoras, recentes estudos comprovam a atividade promotora de crescimento celular do P188. Clincke e colaboradores (2011) demonstraram que a adição de Pluronic F-68 em meio de cultura para células CHO em sistemas estáticos e agitados estimula o crescimento celular, aumenta a viabilidade, reduz a taxa de lise celular em até quatro vezes e ainda proporciona um aumento da produção de γ- interferon.
O Poloxamer P188 é utilizado intensivamente pela indústria de biofármacos como agente protetor das células em cultivo em biorreatores do tipo tanques agitados, por propiciar sua proteção efetiva contra estresse mecânico, podendo ser empregado com sucesso na constituição de membranas porosas de quitosana complexada com xantana úteis no cultivo de células mesenquimais estromais para o tratamento de lesões de pele (BELLINI et al.; 2015).
2.4 Colocação do problema
Frente às lacunas detectadas na revisão bibliográfica realizada, identifica-se que muitos obstáculos ainda são enfrentados na produção de scaffolds para regeneração de cartilagem, como a dificuldade de suprimento de nutrientes nas partes centrais das matrizes, poucas opções para o monitoramento do comportamento celular na matriz, dificuldade de manutenção da produção da cartilagem hialina (BANDEIRAS, et al., 2015) e o fato de que a ação da dexametasona é diferente para cada tipo de célula-tronco mesenquimal estudada e para cada tipo de fator de diferenciação, sendo necessários estudos específicos para células-
tronco dentárias, assim como seu uso em conjunto com a kartogenina.
Desta maneira, verifica-se a importância do desenvolvimento de scaffolds porosos alternativos constituídos por substâncias biocompatíveis e sua associação a compostos que estimulem a diferenciação de células-tronco em condrócitos para o tratamento da osteoartrite. Suportes de quitosana-xantana apresentam potencial aplicação no tratamento de lesões de pele com alta produção de exsudato. Bellini et al. (2015) utilizaram suportes de quitosana- xantana porosos como scaffolds, obtendo resultados satisfatórios na engenharia de tecido dérmico. Porém, não foram localizados trabalhos referentes à associação destes scaffolds a células multipotentes derivadas da polpa dentária, à kartogenina e à dexametasona como fatores de diferenciação para o tratamento de tecido cartilaginoso.
Para suportes constituídos de PCL, também não se localizou na literatura associação com o fator de diferenciação kartogenina. Desta forma, optou-se por analisar o potencial uso de suportes poliméricos porosos, obtidos pela complexação de xantana e quitosana e por eletrofiação de PCL incorporando ou não dexametasona, na presença ou não de kartogenina, como scaffolds para adesão, multiplicação e diferenciação de células-tronco mesenquimais da polpa dentária, destinados ao uso terapêutico em lesões cartilaginosas, como a osteoartrite.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes
3.1.1 Polímeros
Para a produção dos suportes foram utilizados os polímeros quitosana de média massa molecular (190 a 310 kDa) com grau de desacetilação de 75% (Sigma-Aldrich Co.; lote #STBF3507V; referência do produto: 448877), a goma xantana de Xanthomonas campestris (Sigma-Aldrich Co.; lote #108K0038; referência do produto: G1253) e a poli(caprolactona) (Sigma-Aldrich Co.; lote #MKBJ4388V; massa molecular de 70.000 a 90.000 g/mol, referência do produto: 440744).