Extraction des acides nucléiques

2.2.1.1. Extraction d’ADN

Pour l’extraction de l’ADN à partir des feuilles des plantes de riz âgées de 21 jours, nous avons utilisé une méthode d’extraction adaptée à partir du protocole décrit par Saghai-Maroof et

al. en 1984. Les échantillons sont d’abord broyés dans de l’azote liquide, puis sont soumis à de

nombreux traitements. Les échantillons sont traités dans 9 ml de CTAB, afin de solubiliser les membranes cellulaires. Après incubation 30 min à 65°C sous agitation, 5 ml de chloroforme/alcool isoamylique sont ajoutés afin d’extraire les protéines. Après centrifugation pendant 10 min à 10 000 rpm à 4°C, 50 µl de RNAses A à 10 mg/ml (employé afin d’éliminer les ARN) sont ajoutées au surnageant. Une fois homogénéisé et incubé 30 min à 37°C, 200 µl de protéinase K à 20 mg/ml (employé pour la déprotéinisation de l’ADN) sont ajoutées au surnageant. Après incubation 1h à 37°C, 1 ml de tampon CTAB à 10% à 65°C et 7 ml de chloroforme/alcool isoamylique (IAA) sont ajoutés. De nouveau, une centrifugation 10 min à 10 000 rpm à 4°C est réalisée. Une fois le surnageant récupéré, 20 ml de tampon de précipitation sont ajoutés. Après centrifugation 15 min à 12 000 rpm à 4°C, le surnageant est éliminé puis le

Tampon CTAB 2X, pH=8,0 (1litre) CTAB 2% p/v 20g Tris 1,21g EDTA 7,44g NaCl 81,81g PVP 40000 1% 10g H₂O qsp 1 litre

Chloroforme/Alcool isoamylique (1litre) ^{Chloroforme 24V 960 ml}

IAA 1V 40 ml

Tampon TE High, pH=8,0 (1litre)

Tris 1,21g EDTA 0,37g NaCl 58,43g H₂O qsp 1 litre RNAse A à 10 mg/ml RNAse A 100 mg Tris (pH=7,5) 1M 100 µl NaCl 1M 150 µl H₂O qsp 10 ml

Tableau 5 : Les tampons utilisés pour l’extraction d’ADN génomique à partir de feuilles de riz.

MATERIELS ET METHODES

48

culot est repris par 3 ml de TE High. Après incubation du culot jusqu'à dissolution à 65°C, les ADN sont précipités par 6 ml d’éthanol absolu à -20°C puis les échantillons sont centrifugés 15 min à 12 000 rpm à 4°C. Le culot ainsi obtenu est repris dans 500 µl de TE 0.1X. 500 µl de phénol/chloroforme/IAA sont ensuite ajoutés. Après centrifugation 10 min à 12 000 rpm à 4°C, la phase supérieure est récupérée puis 500 µl de chloroforme neutre, afin d’éliminer les traces de phénols, y sont ajoutés. Une centrifugation 10 min à 12 000 rpm à 4°C est ensuite réalisée ce qui permet la récupération de la phase supérieure. 20 µl de NaCl 1M et 1 ml d’isopropanol (employé pour la précipitation de l’ADN) sont ajoutés. A ce stade, les échantillons peuvent être incubés 30 min à -20°C ou 1 nuit à 4°C. Après centrifugation 10 min à 10 000 rpm à 4°C, le surnageant est éliminé puis 1 ml d’éthanol 70% (employé pour les lavages) est ajouté. De nouveau, une centrifugation 10 min à 10 000 rpm à 4°C est réalisée. Une fois le surnageant éliminé, un second lavage à l’éthanol 70% est effectué. Après séchage du culot 10 minutes au speed-vac, le culot est dissout dans du TE 0,1X et finalement stocké à 4°C. Les différents milieux utilisés sont résumés dans le (Tableau 5).

2.2.1.2. Extraction d’ARN

Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles de riz congelées à -80°C âgées de 21 jours. La méthode d’extraction utilisée au cours de ce travail est basé sur une extraction à l’aide de borate, suivie de nombreux traitements au phénol-chloroforme. Cette méthode a été décrite par Bogorad et ses collaborateurs en 1983, et a subi quelques ajustements pour de petites quantités de matériel végétal d’environ 250 mg (Bogorad et al., 1983). En résumé, nous avons broyé les échantillons dans de l’azote liquide puis ces derniers ont subi un certain nombre de traitements. Les membranes cellulaires sont solubilisées dans 900 µl de tampon borate basique pendant 5 minutes à 65°C. Après addition de 900 µl de phénol acide les échantillons sont centrifugés 15 min à 14 000 rpm à 4°C afin, d’éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est récupéré et 900 µl de phénol/chloroforme/IAA est ajouté et les tubes sont centrifugés 15 minutes à 14 000 rpm à 4°C. Les échantillons sont par la suite traités par le chloroforme neutre pour éliminer les traces de phénol. Les ARN totaux sont alors présents dans la phase aqueuse supérieure, tandis que l’ADN se trouve dans la phase phénolique et les protéines à l’interface. Après récupération de la phase aqueuse, les ARN sont précipités par addition d’un volume

Tampon borate (100 ml)

Acide borique 200 mM 1,24g

EDTA 30 mM (6 ml d’une solution mère à 0.5 M, pH 8)

Ajuster à pH=9

Autoclaver

SDS 1% 5 ml d’une solution de SDS 20%

β-mercaptoéthanol 3% _{3 ml}

Chlorure de lithium 10M (50 ml) ^{LiCl 10M 21,2g}

Eau ultra pure qsp 50 ml

MATERIELS ET METHODES

49

d’isopropanol et sont laissés 2 heures à –80°C puis centrifugés 30 min à 14 000 rpm à 4°C. Après élimination de l’isopropanol, le culot d’ARN est lavé à l’éthanol froid, séché puis solubilisé dans de l’eau et traité par le chlorure de lithium pour précipiter les ARN de haut poids moléculaire. Après incubation 1 nuit à 4°C, les échantillons sont centrifugés à 14 000 rpm, 30 min à 4°C. Le culot est ensuite lavé par l’ajout de 500 µl d’éthanol 70% froid puis centrifugé à 12 000 rpm, 5 min à 4°C. Cette opération est répétée 2 fois. Après séchage du culot au speed-vac pendant 10 minutes le culot est solubilisé avec de l’eau stérile. Puis, une digestion DNAsique est réalisée. Après incubation 15 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par de l’EDTA (20 µl). Les échantillons sont par la suite incubés 10 min à 65°C, puis de l’eau stérile (500 µl) ainsi que du phénol chloroforme/IAA (500 µl) sont ajoutés. Une centrifugation 10 000 rpm, 10 min à 4°C est réalisée. 500 µl de chloroforme neutre sont ajoutés au surnageant, puis une centrifugation 10 000 rpm, 10 min à 4°C est réalisée. 2,5V d'éthanol 100% froid et 0,5V d'acétate de sodium 3M sont ajoutés au surnageant. Après avoir mélangé par inversion et laissé 2 heures à –80°C, les échantillons sont centrifugés à 14 000 rpm 30 min à 4°C. Le culot obtenu est lavé par de l’éthanol 70% froid, puis centrifugé 12 000 rpm 5 min à 4°C. Cette opération est répétée 2 fois. Finalement, le culot est séché au speed-vac pendant 10 min puis solubilisé dans 50 µL d’eau stérile.

Une fois l’extraction terminée, les ARN sont conservés à –20°C. La qualité et la quantité des ARN a été vérifié. Tout d’abord, une électrophorèse sur gel d’agarose 1% a été réalisée afin de vérifier l’intégrité des ARN extraits à travers l’observation des bandes correspondant aux ARNr 18S et 28S. D’autre part, un dosage à l’aide d’un Nanodrop (Thermoscientific) a été effectué. Cela nous a permis de déterminer tout d’abord la concentration des ARN totaux pour une densité optique à 260 nm (1 unité de densité optique correspondant à une concentration de 40 µg/ml) et aussi le taux de contamination des ARN par des protéines grâce à une vérification des rapports de densités optiques à 260 et 280 nm (le rapport doit être compris entre 1,8 et 2). Les différents milieux utilisés sont résumés dans le (Tableau 6).