Partie 2 : Développement d’une statégie simplifiée d’obtention des peptaibols par SPPS
C. Résultats complémentaires
2. Extension à l’obtention d’alaméthicine porteuse d’a,a-dialkyl-aminoacide
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Figure 56: Structure tridimensionnelle amphipathique de l’alaméthicine F50/5
Un autre point ayant guidé notre choix de substitution est l’existence d’un gradient croissant de difficulté de couplage du TESDpg à greffer sur une glycine, une alanine ou une proline.
Mais également la possibilité de tester les éventuelles difficultés de couplage que pourrait rencontrer l’aminoacide devant se coupler à sa fonction amine. Ainsi la position 1 permettait de tester la N-acétylation qui constitue un moyen classique de protection des peptides.Les positions 5, 10 et 13 correspondent respectivement aux couplages d’aminoacides, faiblement encombré l’alanine, béta-disubstitué comme la valine qui peut occasionner dans le cas de répétition des couplages difficiles et fortement hydrophobe tel la leucine.
c. Optimisation de la synthèse de l’alaméthicine et application à l’insertion de TESDpg Par ailleurs, le TESDpg étant relativement difficile à produire, nous avons optimiséla synthèse de l’alaméthicine. Pour cela nous avons conservé identique la durée et la température à laquelle s’effectuait le couplage et nous avons réduit à trois le nombred’équivalents d’aminoacide par rapport à la charge initiale de la résine. Dans ses conditions optimisées l’alamethicine F50/5 est obtenue avec un rendement de 35% identique à celui de notre
79 synthèse initiale dans laquelle cinq équivalents étaient utilisés (Tableau 3). Les analogues silylés sont obtenus avec des rendements qui varient entre 8 et 45% selon la position de la substitution.Malgré un double couplage, une chuteimportante du rendement a été observée lorsque l’aminoacide silylé fortement encombré est couplé sur la proline présentant une certaine rigidité conformationnelle peu propice pour la combinaison des deux contraintes. A l’opposé le couplage du TESDpg sur des acides aminés moins contraint procède sans difficulté notable et conduit à des rendements comparables à celui de l’alaméthicine native (Tableau 3). La purification des composés finaux (8-11) a été grandement facilitée grâce à la baisse importante de polarité induite par le TESDpg. En effet, les produits de délétion étaient très faiblement retenus alors que l’analogue silylé était élué en fin de gradient.
Tableau 3: Alaméthicine et ses analogues contenant un TESDpg, rendement et temps de rétention.
Produit Sequences Rdta % -
AcUPUAUAQUVUGLUPVUUQQFol 35- 70 3.2 (82.6)
8 AcUPUA[TESDpg]AQUVUGLUPVUUQQFol 45 - 102 22 (97.6)
9 Ac[TESDpg]PUAUAQUVUGLUPVUUQQFol 8 - 18 20.2 (96.2)
10 AcUPUAUAQUVUGL[TESDpg]PVUUQQFol 9 - 20 20 (96)
11 AcUPUAUAQUV[TESDpg]GLUPVUUQQFol 34 - 75 19.2 (95.4)
a: Rendement aprèspurification parHPLC semi-preparative HPLC. b % final de MeOH permettant l’élution du peptide dans un gradient de80% méthanol (éluent A) 20% H2O (éluent B) à 100% éluent A en 25 min.
d. Etudes structurales des analogues d’alaméthicine
L’étude par dichroïsme circulaire des analogues de l’alaméthicine a été entreprise pour déterminer l’impact de la substitution des résidus Aib par le TESDpg. Dans le méthanol, les quatre analogues montrent un spectre équivalent à celui de l’alaméthicine native
80 caractéristique d’une hélice alpha avec un maximum à 190 nm et deux minima à 208 et 222 nm (Figure 57)
Figure 57: Comparaison des spectres de dichroïsme circulaire de l’alaméthicine et de ses analogues silylés.
e. Effet de la substititution des Aib apr le TESDpg sur l’activité biologique.
L’étude de l’activité biologique de ces composés a été réalisée en collaboration avec V.
Andreu doctorante de notre laboratoire. L’augmentation du caractère hydrophobe des analogues s’accompagne d’une diminution très importante de leur solubilité qui empêche de réaliser des études d’inhibition de croissance de souche bactérienne.Cette perte de solubilité en milieu aqueux a été démontrée en réalisant une étude par HPLC sur le composé 8. Ce composé dissous dans le méthanol à une concentration de 50µM/ml puis injecté juste après la mise en solution et à 24h ne montre pas de variation de l’aire sous la courbe. A la même concentration dans du milieu de culture dès le T0 près de 50% du composé a précipité et au bout de 24h celui-ci est indétectable dans la solution mère que ce soit après décantation ou centrifugation (Figure 58)
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Figure 58 : Etude de la solubilité du composé 8 dans le milieu de culture :(méthanol à t = 24h, milieu de culture t=0h, milieu de culture t=24hcentrifugation, milieu de culture t=24h décantation)
Pour essayer de s’affranchir de ce problème, les tests ont donc été réalisés en boîte de Petri sur gel d’agar en déposant sur des disques buvard les analogues et l’alaméthicine dans 100%
de DMSO. La source bactérienne utilisée est Bascillus subtillis une bactérie gram positive sensible à l’alaméthicine. Pour réaliser ce test un volume de 10µL de DMSO équivalent à celui permettant la solubilisation des composés sert de témoin négatif. Dans ce cas aucune inhibition de la croissance bactérienne n’est observée. Le chloramphénicol un antibiotique à la concentration de 20µg/mL sert de témoin positif et un halo d’inhibition de 22 mm de diamètre est observé. Pour une dose identique l’alaméthicine présente un halo de 17 mm. Par contre il n'y a pas d'inhibition pour les analogues déposés à 20µg par disque, on constate en effet que les colonies bactériennes viennent dans tous les cas au contact du disque (Figure 59). Ces résultats ont été confirmés par des tests de croissance bactérienne réalisés à l’IBMM.
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Figure 59 : Inhibition de la croissance de colonies de Bascillus subtilis.
f. Hypothèse quant à la perte d’activité biologique.
L’absence d’effet biologique des analogues 8-10 peut éventuellement s’expliquer par l'encombrement l'encombrement stérique des groupements TESDpg qui empêche l’autoassociation des monomères monomères d’alaméthicine pour former les pores.182,183En effet quel que soit la position du résidu Aib
résidu Aib substitué celui-ci se trouve à l’interface entre deux hélices (
Figure 61). Cette hypothèse est en cours d’étude.
83 Vue de dessus du pore membranaireVue de côté du pore
Résidus Aib substitués : Aib 1 (jaune) ; Aib 5 (rose) ; Aib 10 (cyan) ; Aib 13 (blanc)
Reconstruction du TESDpg remplaçant l’un des Aib 13 mettant en évidence des gênes stériques (pointillé rouge)
Figure 60 : Exemple d’autoassociation de six alaméthicines pour former un pore183
L’ensemble de ces résultats est développé dans un article qui a étéacceptédans Organic letters.
Ma participation à ce travail a consisté en la synthèse des analogues d’alaméthicine et en leurs purifications.
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