Expression de VGLUT2 dans les neurones dopaminergiques en culture

1.1 Expression de VGLUT2 dans les neurones dopaminergiques en culture

La principale conclusion de l’étude menée sur les neurones dopaminergiques en culture est que ces neurones ont la capacité d’exprimer un des 3 transporteurs vésiculaires du glutamate. A l’instar des neurones sérotoninergiques qui expriment uniquement VGLUT3, ou des neurones noradrénergiques qui n’expriment que VGLUT2, les neurones dopaminergiques du mésencéphale expriment spécifiquement et uniquement le transporteur vésiculaire de type 2 soit VGLUT2. En effet, aucune expression d’un des 2 autres VGLUTs n’a été retrouvée dans les neurones dopaminergiques dans notre modèle in vitro. Nos données fournissent la première démonstration claire que ces neurones peuvent exprimer un phénotype glutamatergique, attestant de leur capacité à libérer du glutamate en plus de la dopamine.

Dans notre première étude, nous avons montré que la grande majorité (80%) des neurones dopaminergiques isolés était immunopositive pour VGLUT2 grâce à l’utilisation d’un modèle de culture qui permet d’isoler un neurone sur une goutte de collagène sur laquelle des astrocytes se sont préalablement développés (Sulzer et al., 1998 ; Bourque & Trudeau, 2000 ; Fasano et al., 2008). Le neurone peut ainsi se développer sans contact avec d’autres neurones, et établit sur lui-mêmes des contacts synaptiques appelés autapses. Cette condition expérimentale était nécessaire pour évaluer si la protéine VGLUT2 était bien présente dans les neurones dopaminergiques. En effet, la protéine est retrouvée que dans les prolongements axonaux mais n’est pas exprimée dans les corps cellulaires ni les dendrites des neurones. Cette expression exclusive dans les axones explique la différence entre nos résultats et la faible expression de VGLUT2 observé par immunomarquage sur des tranches de cerveau de rats dans l’ATV et la SN (Fremeau et al., 2002 ; Varoqui et al., 2002), et

suggère que la présence de la protéine VGLUT2 provient d’autres neurones projetant dans le mésencéphale ventral.

Pour enlever tout doute sur une expression artéfactuelle de VGLUT2 dans les neurones dopaminergiques en culture, nous avons mis des neurones sérotoninergiques dans les mêmes conditions de cultures et démontré que comme in vivo, ces neurones n’expriment que VGLUT3 (Fremeau et al., 2002, Gras et al., 2002). L’autre grande population de neurones qui composent nos cultures sont des interneurones GABAergiques (Michel & Trudeau, 2000). Tout comme pour les neurones sérotoninergiques, nous avons observés que les neurones GABAergiques dans nos conditions de culture n’expriment pas VGLUT2, attestant une fois de plus de l’expression spécifique de cette isoforme dans les neurones dopaminergiques. Notons par ailleurs que nous avons montré la présence de neurones purement glutamatergiques dans nos cultures, exprimant uniquement VGLUT2 ceux-ci pourraient être des neurones projetant au cortex préfrontal médian, tel qu’il a été suggéré par des expériences de marquage rétrograde sur des rats adultes (Hur & Zaborszky, 2005).

Le fait que la grande majorité des neurones dopaminergiques expriment VGLUT2 en culture est en opposition avec les premiers travaux d’hybridation in situ qui n’ont pas détecté d’ARNm de VGLUT2 dans le mésencéphale de rats adultes in vivo. En considérant que nos cultures sont préparées à partir de cerveau de rats nouvellement nés (entre 0 et 2 jours postnataux), on peut penser que l’expression de VGLUT2 dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale est régulée au cours du développement normal des animaux. Au cours de la période embryonnaire cette expression serait forte et diminuerait progressivement après la naissance. Dans cette optique, nous nous sommes intéressés à l’expression de la protéine VGLUT2 à différents temps après la mise en culture. Nous avons observé que dès les premières heures suivant la mise en culture, la présence de la protéine est détectable. En effet, 24h après la mise en culture la moitié des neurones dopaminergiques isolés exprimaient déjà VGLUT2. Cette expression est très intéressante car les prolongements axonaux ne sont pas encore bien développés et la présence de la protéine a été observée dans les corps cellulaires des neurones. A des temps plus tardifs, la

proportion de neurones dopaminergiques immunopositifs pour VGLUT2 a graduellement augmenté pour atteindre un plateau à 7 jours après la mise en culture, période où les contacts synaptiques entre les neurones en culture sont considérés fonctionnels (Bourque & Trudeau, 2000).

Donc nous avons montré que l’expression de VGLUT2 est rapide, sélective et persiste dans les neurones dopaminergiques en culture. Toutefois, les différences de proportion observées in vitro et in vivo nous obligent à préciser nos conclusions. L’utilisation de notre modèle de culture possède un intérêt particulier car il permet d’observer les terminaisons des neurones dopaminergiques et donc de détecter la protéine VGLUT2 dans les neurones identifiés. Le fait que les premières études d’hybridation in situ n’aient pas révélé d’expression d’ARN de VGLUT2 dans le cerveau n’exclue pas un faible niveau d’expression dans les neurones dopaminergiques in vivo. Toutefois, pour tester cette hypothèse des approches différentes sont nécessaires telle que la RT-PCR sur cellule unique. Dans une autre étude menée dans notre laboratoire, nous avons tiré profit d’une souris exprimant la protéine fluorescente verte (GFP pour l’anglais « green fluorescent protein ») sous le control du promoteur de la tyrosine hydroxylase (Sawamoto et al., 2001). Les neurones dopaminergiques dans ces souris expriment dans une forte proportion (92%) la GFP (Jomphe et al., 2005). A partir de ces souris, nous avons pu mettre en évidence que la majorité (92%) des neurones TH-GFP isolés en culture exprimaient aussi l’ARNm de VGLUT2 (Mendez et al., 2008). Mais, fait intéressant, toujours grâce à l’utilisation de ces neurones, nous avons pu montrer que la proportion de neurones dopaminergiques exprimant l’ARNm de VGLUT2 était différente suivant les conditions de cultures. Dans les conditions de cultures normales, dites standard, contenant des neurones GABAergiques et dopaminergiques, la proportion de neurones TH-GFP exprimant les ARNm de VGLUT2 n’est plus que de 14%. D’autre part, dans des cultures préparées à partir de neurones dopaminergiques TH-GFP purifiés par FACS (pour l’anglais « fluorescent-associated cell sorting »), la proportion de neurones dopaminergiques exprimant l’ARNm de VGLUT2 est de 45% (Mendez et al., 2008). Ces résultats suggèrent d’une part, que dans notre système

de micro-cultures le phénotype glutamatergique est probablement surexprimé et d’autre part, que les neurones dopaminergiques ont la capacité d’induire l’expression de VGLUT2 suite à une perturbation de leurs conditions environnementales.