Expression et purification de protéines recombinantes

Les protéines purifiées sont des réactifs clés pour de nombreux tests qui permettent parfois de comprendre des points fondamentaux comme la structure, la fonction ou la régulation des protéines. Leur disponibilité est donc essentielle.

Généralement, les systèmes d’expression et de purification automatisés se font en format de microplaques. Mais on peut aussi automatiser des purifications haut-débit en format plus grand. En effet, Scott A. Lesley rend compte d’une purification automatisée simultanée de 96 protéines à partir de 96 cultures bactériennes de 70 ml utilisant des automates spécialisés avec des rendement moyens de 10 mg de protéines (Lesley, 2001).

III.2.1.1 Les systèmes d’expression

Le système d’expression le plus utilisé et le mieux adapté au haut-débit est le système bactérien Escherichia coli. Ses principaux avantages sont la robustesse du système, le faible coût et la facilité d’utilisation. Un excellent exemple d’application de ce dernier est l’étude du protéome de Methanobacterium thermo-autotrophicum pour lequel 424 protéines non-membranaires ont été clonées et produites dans E. coli pour des analyses structurales. 80% de ces protéines ont pu être exprimés et 100 d’entre elles étaient solubles. 10 structures tridimensionnelles ont été résolues dans cette étude (Christendat et al., 2000). Mais cette méthode d’expression présente aussi de nombreux inconvénients comme la formation de corps d’inclusions, le repliement non natif des protéines et le manque de modifications

post-traductionnelles. C’est pourquoi d’autres méthodes d’expression ont été amenées à l’automatisation.

Bien que plus difficile à mettre en œuvre, les systèmes d’expression eucaryotes sont souvent incontournables pour certaines protéines. Ils ont notamment la propriété de glycosyler et de phosphoryler les protéines recombinantes. Les levures Saccharomyces cerevisiae et

Pichia pastoris sont les organismes eucaryotes les plus utilisés dans le haut-débit (Boettner et

al., 2002; Holz et al., 2002). Les cellules de mammifères sont la méthode de choix pour l’expression de protéines humaines, mais elles présentent deux inconvénients majeurs qui sont leur fragilité et leurs faibles niveaux d’expression. Un compromis entre ces deux méthodes est le système d’expression en cellules d’insectes. Celui-ci conserve l’avantage d’une certaine robustesse ainsi que d’une bonne expression et permet des modifications post-traductionnelles proches de celles des cellules de mammifères (Gilbert et al., 2002).

Les systèmes d’expression acellulaires sont particulièrement bien adaptés à l’automatisation à cause de l’absence de membranes cellulaires, ce qui permet de s’affranchir de l’étape d’intégration de l’ADN dans les cellules, de la lyse cellulaire et de la clarification du lysat. L’absence de cellules vivantes évite les problèmes de toxicité et l’ouverture du système permet des manipulations directes des conditions réactionnelles (Betton, 2004). De plus, les systèmes d’expression utilisant des lysats de cellules eucaryotes ont l’avantage de faire les modifications post-traductionnelles adéquates (Braun et al., 2003). Les systèmes les plus courants se basent sur des lysats de bactéries, de germes de blé et de réticulocytes. Des rendements de 6 mg.ml^-1 de protéines purifiées peuvent être atteints avec ce type de système (Kigawa et al., 1999).

III.2.1.2 Criblage d’expression et de solubilité

Dans les processus haut-débit, la première étape consiste souvent à tester différentes conditions d’expression en faisant varier des paramètres comme la température, la souche d’expression, les milieux de culture, l’étiquette de la protéine et sa localisation N- ou C-terminale pour identifier un protocole qui maximise la quantité de protéines solubles récupérées. Certains groupes ont développé des tests de criblages pour rapidement estimer la solubilité des protéines. Pour éviter les longs processus de lyse et de purification, des protocoles de criblages in vivo ont été mis au point (Wigley et al., 2001; Lesley et al., 2002a). Wigley et al. ont ainsi développé une méthode se basant sur la complémentation structurale

des fragments α et ω de la β-galactosidase. Dans ce système, l’activité enzymatique est corrélée avec la solubilité des protéines fusionnées avec le domaine α.

D’autres approches plus fiables et plus directes consistent à faire soit des micro-purifications, soit des lyses suivies de quantifications relatives des protéines solubles par ELISA (Lesley et al., 2002a), dot-blot (Knaust et al., 2001; Busso et al., 2003; Vincentelli et al., 2005), spectrométrie de masse (Chance et al., 2002) ou SDS-PAGE (Braun et al., 2002; Hammarstrom et al., 2002; Shih et al., 2002).

III.2.1.3 Lyse

Les lyses cellulaires sont généralement chimiques, bien qu’il existe maintenant des instruments de lyse par ultrasons adaptés au haut-débit (Moreland et al., 2005). Les cellules sont lysées par une incubation dans un tampon contenant du lysozyme ou dans un tampon de lyse commercial tel que le BugbusterTM de Novagen, le CelLyticTM de Sigma ou le PopcultureTM de Invitrogen. Pour diminuer la viscosité du lysat, on rajoute souvent une nucléase.

La lyse peut se faire directement sur les cultures ou sur les culots de bactéries. Un cocktail d’inhibiteurs de protéases peut être ajouté lors de cette étape pour limiter la dégradation des protéines au cours de la purification.

III.2.1.4 Purification

On peut considérer que la purification par affinité de protéines portant une étiquette est une règle générale dans les approches automatisées (Acton et al., 2005). L’étiquette 6xHistidine est la plus répandue à cause de sa petite taille qui limite probablement l’encombrement stérique, de son affinité relativement forte pour les colonnes d’affinité aux ions métalliques, et de sa fonctionnalité dans des conditions dénaturantes. Cette étiquette n’est malheureusement pas très efficace pour les protéines eucaryotes. Des étiquettes plus grandes comme la GST (« Gluthation-S-Transférase ») et la MBP (« Maltose Binding-Protein ») sont plus adaptées pour ces dernières car elles ont un effet stabilisant et solubilisant (Murby et al., 1996; Braun et al., 2002; Waugh, 2005).

La fixation des protéines, les lavages et l’élution se font soit en microplaques de filtration associées à un bloc de filtration pour des purifications sur des résines d’affinité classiques (Scheich et al., 2003), soit en microplaques normales associées à un élément magnétique pour des résines d’affinité couplées à des billes magnétiques (Lin et al., 2005a).

Les manipulations sont généralement faites sur une plateforme automatisée ayant tous les éléments nécessaires, évitant ainsi les interventions manuelles.

III.2.1.5 Repliement in vitro

Un des points critiques dans l’expression de protéines hétérologues dans E. coli est la formation fréquente d’agrégats amorphes de protéines mal repliées appelés corps d’inclusions. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des méthodes de repliement des protéines qui se trouvent sous forme agrégée.

La stratégie générale de renaturation des protéines consiste en l’isolation des corps d’inclusions, en la solubilisation en présence de hautes concentrations en agents chaotropes, en la purification de la protéine dénaturée et finalement au repliement en retirant de manière contrôlée l’agent dénaturant. La dernière étape de changement de tampon peut se faire par dilution, par dialyse, par dia-filtration ou sur colonne (Li et al., 2004). Pour vérifier le bon repliement de la protéine, un test fonctionnel est souvent mis en œuvre. Mais cela implique de connaître la fonction de chaque protéine, ce qui est rare dans les approches haut-débit. Des méthodes telles que le dichroïsme circulaire, la fluorescence, la diffusion dynamique de lumière ou encore la sensibilité aux protéases (Heiring et al., 2001) se sont donc développées.

Bien que Maxwell et al. rendent compte que l’hydrochloride de guanidine est un agent dénaturant généralement efficace sur des protéines d’une masse inférieure à 18kDa (Maxwell et al., 2003), on peut affirmer qu’en règle générale il n’y a pas de tampon de renaturation universel. C’est pourquoi certains groupes ont développé des méthodes haut-débit de criblage de conditions de repliement de protéines (Vincentelli et al., 2004; Lin et al., 2005b).