Exploration du rôle des monocytes/macrophages : étude du polymorphisme du

2.2.1.1. Populations étudiées

L'étude génétique était réalisée à partir de deux cohortes.

Tous les patients présentant une NIgA prouvée par biopsie rénale diagnostiqués entre 1979 et 2009, majeurs au moment du diagnostic, affiliés au régime de sécurité sociale et pour lesquels un échantillon d'ADN exploitable était disponible ont été inclus dans l'analyse. Le critère diagnostique de maladie de Berger était immuno-histologique, correspondant à la présence de dépôt d'IgA dans le mesangium glomérulaire côté 1+ selon une échelle semi quantitative. Seuls les patients ayant fourni leur consentement exprès au moment du prélèvement ou au cours du suivi de la cohorte ont été inclus dans l'étude. Un courrier sera adressé à tous les patients de la cohorte pour les informer de la réalisation de cette étude et pour leur permettre d'exprimer leur refus. D'autre part, seuls les sujets caucasiens et les sujets suivis dans le centre de Saint-Étienne ont été retenus dans l'analyse. Cette première cohorte permettra l'analyse pour l'étude de susceptibilité génétique en comparaison avec les volontaires sains.

Pour l'étude d'association génétique, seule la sous-population des patients inclus de 1979 à 1999 a servi à l'analyse, permettant un recul moyen suffisant.

La cohorte de volontaires sains rassemble un ensemble d'individus matchés en âge et en sexe, ayant signé un consentement éclairé au moment du prélèvement. Les critères d'inclusion étaient l'absence de maladie chronique et l'affiliation au régime de sécurité sociale.

Cette collection biologique a été déclarée au ministère de la santé suite à l'arrêté ministériel de mars 2007 et constitue une cohorte exhaustive de patients consécutifs. 2.2.1.2. Extraction de l'ADN

64 Cette extraction a été réalisée à partir d'un culot de leucocytes obtenus à partir de sang total après traitement par une solution de lyse des globules rouges et centrifugation. Le culot leucocytaire est ensuite congelé à -20°.

Le culot était ensuite récupéré, homogénéisé dans la solution d'extraction (10 ml). Une digestion enzymatique était ensuite réalisée par l'ajout de 0,1 ml de solution de protéinase K à 10 mg/mL suivie d'une incubation à 37° sous agitation constante pendant une nuit permettant d'obtenir une solution parfaitement homogène.

Une extraction au phénol était ensuite réalisée sous hotte. Le phénol était préparé extemporanément par récupération de la phase supérieure obtenue par l'ajout d'un tampon pH 8 fourni avec la solution mère. 10 ml de phénol étaient ajoutés à l’homogénat cellulaire, le tube était ensuite agité durant 10 minutes, centrifugé 5 min à 3000 tours par minute et la phase aqueuse est récupérée. Celle-ci était traitée successivement par 10 ml de phénol chloroforme (solution 1/1), puis 10 ml de chloroforme-isoamyalcool (solution 24/1) à deux reprises avec à chaque étape une agitation suivie d'une centrifugation 5 min à 3000 tours par minute et la récupération de la phase aqueuse. Enfin, une solution de NaCl 5M était ajoutée à la quantité de 40µL/mL de solution.

La précipitation de l'ADN était ensuite également réalisée sous hotte. Elle était permise par l'ajout de deux volumes de solution absolue d'éthanol conservée à -20°C. L'ADN était ensuite récupéré par une pipette pasteur introduite dans le tube jusqu'au fond. Le bout de cette pipette était ensuite plongé dans de l'éthanol à 70° conservé à 4°C. Le surplus d'alcool était retiré par l'application d'un buvard, le bout de la pipette était sectionné et laissé à sécher dans un tube à hémolyse stérile une nuit.

L'ADN était ensuite dissous dans 1 ml de trichloréthylène à pH 8 sous agitation pendant une nuit à 4° et un dosage permettait d'ajuster la concentration à 200µg/mL. Les aliquots étaient ensuite congelés à -20°C.

2.2.1.3. Discrimination allélique par PCR quantitative en temps réel

Les échantillons d'ADN étaient ensuite dilués au 1/10 dans de l'eau distillée. Le volume du milieu réactionnel de la PCR était de 25µL par puits et était composé de :

 12,5µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix, contenant la Taq polymérase de type hot start Taq polymérase (AmpliTaq Gold ®DNA Polymérase), les

65 désoxyribonucléotides (dUTP, dATP, dCTP, dGTP),la référence interne passive ROX (permettant de normaliser tous les phénomènes qui ne sont pas dépendants de la réaction PCR comme les erreurs de pipetage), l’AmpErase UNG (système de décontamination), tampon et ions nécessaires à la PCR.

 0,625 µl de TaqMan® SNP Genotyping assay mix, contenant les primers spécifiques de la PCR et la sonde TaqMan®MGB (reporter en 5’ marqué par FAM TM et VIC ^TM pour différencier l’amplification de chaque allèle) (Assay ID : C_25472878_10)

 6,875 µl d’eau distillée

 5 µl d’ADN dilué

La réaction de PCR était réalisée sur un automate Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System (ABI PRISM 7500 system) utilisant des plaques de 96 puits. On utilisait un puits par patient et trois puits de contrôles négatifs sans ADN (NTC : non template control) pour vérifier l'absence de contamination de la manipulation. La discrimination allélique ne nécessitait pas la réalisation de duplicata compte tenu de l'absence de résultats quantitatifs.

Les étapes de la PCR suivaient les recommandations du fabricant et comprenaient :

 2 étapes initiales de deux minutes à 50° (activation AmpErase UNG) et 10 minutes à 95° pour activer la Taq polymérase et désactiver l’AmpErase UNG.

 40 cycles comprenant chacun une étape de dénaturation de 15 secondes à 92°C et une étape d’annealing /extension d’une seconde à 60°C.

La discrimination allélique se faisait par l'analyse automatique des résultats par l'automate en point final par le « post read run ». L’allèle A était spécifiquement reconnu par la sonde marquée par VIC® et l’allèle G par la sonde marquée par FAM ®. Ainsi l’homozygote A : donnait un signal de fluorescence VIC. Ainsi l’homozygote A était caractérisé par un signal de fluorescence VIC, l’homozygote G un signal de fluorescence FAM, et l’hétérozygote G/A donnait les 2 signaux de fluorescence.

66 La première analyse était celle de la vérification que la relation entre les trois génotypes AA, AG et GG et la fréquence des allèles suivait bien l'équilibre de Hardy-Weinberg par un test du χ².

L'objectif principal de l'étude était la comparaison de la fréquence de l'allèle Gly²⁴⁸ (allèle G) chez les patients porteurs de maladies de Berger par rapport à des volontaires sains. Cette comparaison était permise par un test du χ². La fréquence de l'allèle décrite pour les sujets caucasiens est de 15 % environ. Pour mettre en évidence une augmentation de fréquence de 70 % chez les patients porteurs de la maladie (soit une fréquence de 26 %) avec un risque alpha de 5 % et un risque béta de 10 %, il était nécessaire d'inclure un minimum de 278 patients dans chaque groupe. Les résultats sont considérés comme significatifs au seuil de 5 %.

Les objectifs secondaires comprennent :

 l'étude de la corrélation entre la présence de l'allèle Gly248 et la survie rénale chez les patients porteurs de maladie de Berger appartenant à la cohorte et pour lesquels il existait un recul suffisant (cohorte 1979-1999). L'analyse a été réalisée par des méthodes univariables (Kaplan Maier, test du LogRank, modèle de Cox univariable) et des méthodes multivariables (Cox) prenant en compte les différents facteurs de risques connus d'évolution vers l'insuffisance rénale terminale (protéinurie, insuffisance rénale chronique, hypertension artérielle, score histologique de gravité au moment du diagnostic).

 l'étude d'association avec les différents paramètres d'activité au moment du diagnostic : la protéinurie (test t de Student), insuffisance rénale chronique (taux de créatininémie et débit de filtration glomérulaire estimé par la formule MDRD, test t de Student), hypertension artérielle (test du χ²), score histologique de gravité (test t de Student et χ²).

2.2.2. Etude du rôle des lymphocytes T : étude de la polarisation lymphocytaire T au cours de