iniciou pela adição de 200mU de extrato enzimático ao meio reacional. Este era composto por um volume total de 1500L contendo 3,125 mol de Na-fitato em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0. A partir do meio reacional, 100 L de amostra foram removidos periodicamente durante 8h e a reação enzimática interrompida por tratamento térmico (95°C, 5 minutos). Em seguida, as amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para identificação dos produtos. Este mesmo preparado contendo fitato e seus produtos de hidrólise foi usado para avaliar o potencial antioxidante dos mioinositóis.
6. Métodos analíticos
6.1. Determinação de proteínas totais
A dosagem de proteínas do extrato enzimático foi feita de acordo com o método de Bradford (1976). Para tanto, quantificou-se a coloração azulada (595nm) adquirida pela ligação do corante Coomassie-Blue G-250 com os grupos funcionais básicos ou aromáticos das proteínas. A absorbância foi relacionada à concentração de proteínas a partir da curva de calibração construída com o padrão soro-albumina bovina (BSA), e a concentração expressa em miligramas por mililitro (mg/mL).
6.2. Determinação da atividade enzimática em substrato fitato de sódio A determinação da atividade de fitase utilizando ácido fítico sal di- hidratado dodecasódico (fitato de sódio, Na-fitato) quantificou o fosfato liberado pelo método do molibdato de amônio (HEINONEN e LAHTI, 1981) com pequenas modificações. O meio reacional foi composto por 350 μL de solução 2,8 mM de fitato de sódio em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, acrescidos de 10 μL de extrato enzimático. Esta solução foi incubada em banho-maria por 30 minutos a 37°C. Em seguida, a reação foi interrompida pela adição de 1500 μL do reagente de cor para formação de fosfomolibdato e após 2 minutos foram adicionados 100 μL de ácido cítrico 1,0M e a reação foi centrifugada à 10000rpm (10300xg) por 2 min. O reagente de cor utilizado foi composto por 1 volume de molibdato de amônio 10mM, 1 volume de solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 5N e 2 volumes de acetona. O
fosfato inorgânico liberado foi quantificado em espectrofotômetro à 355 nm. O curso da reação foi acompanhado a partir da curva padrão de fosfato de potássio dibásico (K2HPO4). Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar um micromol (µmol) de fosfato por minuto e expressa em unidades por mililitro (U/mL). Quando usado miliunidades (mU) siginifca que a atividade foi multiplicada por mil.
6.3. Determinação da atividade enzimática em substrato p-nitrofenilfosfato dissódico (pNPP)
Empregando-se substrato sintético para fosfatases (p-nitrofenilfosfato dissódico, também chamado de 4-nitrofenilfosfato dissódico), foi determinada a atividade enzimática conforme procedimento proposto por Stöckmann et al. (2003) com pequenas modificações. À 200 μL de solução 5 mM de pNPP em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 foram adicionados 10 μL de extrato enzimático. Após 30 minutos de incubação em banho-maria a 37°C, a reação foi interrompida pela adição de 1000 μL de NaOH 1,0 M com desenvolvimento de coloração amarela proporcional a liberação de p-nitrofenol, e então quantificada à 405 nm em espectrofotômetro. O curso da reação foi acompanhado por uma curva padrão de p- nitrofenol (pNP). Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um micromol (µmol) de pNP por minuto e expressa em unidades por mililitro (U/mL). Quando usado miliunidades (mU) siginifca que a atividade foi multiplicada por mil.
6.4. SDS-PAGE
A fim de acompanhar as etapas de purificação da enzima, foram produzidas eletroforeses em gel de poliacrilamida (12,5%) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) como agente desnaturante, segundo método proposto por Laemmli (1970).
Cada amostra consistia de 100 µL das frações coletadas durante as etapas de purificação, concentradas por evaporação e ressuspendidas em tampão Tris-HCl 0,5M, pH 6,8, contendo 10% (m/v) de SDS, 10% (v/v) de glicerol, 5% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 0,05% (m/v) de azul de bromofenol. Foi utilizado como marcador de massa molecular o kit Precision Plus Protein Dual Color StandardTM da
Bio-Rad. Este kit é composto por dez proteínas com massas moleculares de 250 kDa, 150kDa, 100kDa, 75kDa, 50kDa, 37kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa e 10kDa. Após o término da corrida, o gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue R250.
6.5. Análise por HPLC dos isômeros de mioinositol
A análise dos mioinositóis foi realizada segundo metodologia usada por Schlemmer et al (2001). Os mioinositóis (IP2-IP6) (100 µL) foram separados em resina Mono-Q em uma coluna curta (5 cm; HR 5/5, Pharmacia), e obteu-se uma boa separação dos diferentes isômeros de fosfato de inositol em um curto período (<30 min). Um sistema de HPLC inerte foi aplicado (bomba de gradiente 2249 e um misturador de baixa pressão; Pharmacia) e usado um gradiente de HCl (5mM a 500mM; fluxo 1,0 ml/min). Para melhorar a separação dos isômeros de fosfato de inositol e proteger a coluna, uma camada de Source 20 (1,0 cm, Pharmacia) foi colocada no topo da coluna Mono-Q, criando um sistema de coluna única. A derivatização pós-coluna foi obtida por mistura do eluente com 100mM de HCl, contendo 5,18mM de FeCl3 e 250mM de NaCl, por meio de uma bobina PTFE
enrolada (comprimento 8,0m; diâmetro 0,5mm) (bomba de HPLC 2248, Pharmacia; fluxo: 0,8 mL/min). A absorção foi medida à 290nm (detector UV-Vis VWM 2141, Pharmacia). Os picos foram identificados por adição de padrões de fosfatos de inositol. Os cromatogramas foram avaliados pelo software PC Integration Pack.
7. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis por sequestro de radicais livres in vitro
7.1. Ensaio de capacidade de absorbância do radical oxigênio (ORAC) O método ORAC proposto, com fluoresceína (FL) (Sigma) como “sonda de fluorescência”, foi descrito por Ou et al. (2002) e adaptado por Macedo et al. (2011). O método automático de ORAC foi realizado em um leitor de placas NovoStar Microplate reader (BMG Labtech, Germany) com filtros de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 520 nm. As medidas foram feitas em uma placa tipo COSTAR 96. A reação deu-se a 37° C e baseou-se na termo-decomposição do AAPH [2,2'-Azobis (2-amidinopropano) dihidroclorídeo] (SIGMA) em tampão fosfato 75 mM, pH 7,4 devido a sensibilidade da FL ao pH. A solução do padrão de controle 75 M Trolox
(Sigma) foi preparada em tampão fosfato, e diluído para soluções de 1500 – 1,5 mol/mL para a curva padrão. Em cada poço, 120L de solução de FL e 20L de solução de amostra, ou tampão fosfato no caso do branco, ou ainda solução padrão de Trolox foram adicionados de 60L de AAPH (12 mM). A fluorescência foi
quantificada imediatamente após a adição dos componentes da reação, e depois a cada 6 min durante 87 min. Os valores de ORAC foram calculados pela diferença entre a área sob a curva de decaimento da fluorescência de cada amostra e do branco (net AUC). Os valores de ORAC-FL foram expressos como μMol de Trolox equivalente/mg de amostra.
7.2. Ensaio de sequestro de radicais DPPH (2,2, difenil, 1 picrilhidrazila) O potencial antioxidante também foi dosado pelo método de sequestro de radicais DPPH (2,2, difenil, 1 picrilhidrazila) (Sigma). Esse método se baseia na capacidade dos antioxidantes presentes nas amostras em sequestrar o radical estável DPPH de acordo com Peschel et al. (2006) e adaptado por Macedo et al. (2011). As amostras foram preparadas em diferentes concentrações (0,5 – 5,0mg/mL) e diluídas em metanol 70% (v/v). As misturas reacionais consistiram em 50 L das amostras testadas e 150 L de DPPH 0,2mM em metanol. As reações foram preparadas em placas de 96 poços (BMG Labtech 96) e acompanhadas ao longo de 90 mim em um leitor de placas NovoStar Microplate reader (BMG Labtech, Germany) com filtro de absorbância de 520 nm. A leitura foi comparada contra o branco controle e os resultados expressos em termos de μMol de Trolox equivalentes/mg de amostra.
RESULTADOS E DISCUSSÃO