CHAPITRE 3 CONCEPTION, FABRICATION, CARACTÉRISATION ET OPTIMISATION
3.6 Exemple d’utilisation : détection de PpIX
La validation de la précision du système de fluorescence est effectuée en utilisant un fluorophore parfois employé durant la résection de tumeurs cérébrales, la protoporphyrine IX (PpIX). Les concentrations allant de 0,02 à 5 µg/mL correspondent au niveau de PpIX présent dans les tissus normaux ou pathologiques suivant l’administration de 5-ALA. Ainsi, deux séries de dilutions sont faites avec différentes concentrations de PpIX (5, 1,25, 0,313, 0,078, 0,02 et 0 µg/mL), chaque série ayant un coefficient d’absorption µa différent mais le même coefficient de diffusion µs’ = 25 cm-1 à la longueur d’onde d’excitation. Le fantôme optique appelé C est caractérisé par un µa de 20 cm-1 alors que le fantôme appelé F possède un µa de 40 cm-1. Les coefficients d’absorption sont respectés en utilisant différents volumes d’eau et d’intralipide, dont les coefficients optiques sont connus. Une petite quantité d’éthanol est nécessaire afin de créer une solution mère fluorescente, puisque la PpIX s’y dissout beaucoup mieux que dans l’eau. La concentration finale reste cependant minime par rapport aux autres constituants. Puisque la PpIX possède un pic majeur d’excitation à 405 nm, seule cette source est utilisée pour cette expérience. Les spectres bruts de fluorescence sont présentés à la Figure 3.17, où il est possible de remarquer les pics d’émission. Au chapitre 1, le spectre théorique a été vu, avec un pic de fluorescence majeur à 635 nm, avec un second, moins intense, à 700 nm. L’intensité de ces pics semble proportionnelle à la concentration, telle qu’indiquée dans la légende de la Figure 3.17.
Afin d’étudier l’efficacité de détection du système en fluorescence, l’intensité du pic majeur à 635 nm est mesuré pour les dilutions C et F. Sur le premier graphique de la Figure 3.18, l’intensité semble être linéaire par rapport à la concentration de PpIX présente dans la solution, et ce pour les deux séries. Avec une concentration de 0,02 µg/mL, l’intensité des pics est difficilement visible sur les spectres à la figure précédente. Avec le graphique représentant la relation entre l’intensité et la concentration, on remarque une très légère différence, mais avec une échelle logarithmique en x (deuxième graphique) cette différence n’est pas notable. On pourrait donc conclure que le seuil de détection se trouve entre 0,078 et 0,02 µg/mL. Il faudrait cependant effectuer les mêmes tests avec davantage de dilutions avant de tirer des conclusions. Il serait logique de penser que la limite de détection serait grandement améliorée avec une source lumineuse davantage puissante, puisque l’intensité de celle-ci à la sortie de la sonde est minime. Toutefois, un seuil de détection autour de 0,1µg/mL permet un diagnostic positif à plus de 90 % [65], [73], donc le système pourrait être utilisé tel quel en salle d’opération pour détecter la PpIX avec succès.
Une relation quantitative pourrait être déduite de ces graphiques, notamment en se basant sur les nombreux travaux du groupe de recherche [2], [6], [59], [65], [74]. Cependant, ce projet se concentre davantage sur la fluorescence intrinsèque et la classification de tissus en comparant des spectres que sur la quantification de fluorophores : c’est pourquoi cet aspect est omis dans le présent document.
Figure 3.18 : Proportionnalité de l’intensité du pic de fluorescence à 635 nm par rapport à la concentration de PpIX pour les dilutions C et F. Les points correspondent aux différentes concentrations (de 0 à 5 µg/mL). En haut : la mesure de l'intensité du pic de fluorescence est linéaire par rapport à la [PpIX]. En bas : visualisation avec une échelle semilogarithmique.
3.6.2 Étude combinée à large champ et échantillons ex vivo
Dans le cadre d’une autre étude portant sur l’exactitude de la détection augmentée en fluorescence d’une caméra hyperspectrale EMCCD (Nüvü Caméras) lorsque comparée au microscope chirurgical usuel (microscope Pentero de Zeiss), des mesures sont prises avec des échantillons ex vivo (article soumis [75]). Deux rats affectés d’un GBM exogène ont été sacrifiés après l’administration de 5-ALA, utilisée dans le but de rendre les tumeurs positives au PpIX. Un total de huit tranches de cerveau provenant des deux animaux est imagé en fluorescence et en réflectance (excitation par la source 405 nm et la source blanche du microscope, respectivement), à la fois par le système hyperspectral et par le microscope chirurgical. Une mesure est prise avec le système de sonde optique sur chaque tranche à l’endroit où l’intensité maximale de fluorescence était visible suivant l’imagerie grand champ. Le pic de fluorescence caractéristique de la PpIX est clairement visible lors de chaque acquisition sur la tumeur, comme le montre l’exemple ci-dessous (Figure 3.19).
Figure 3.19 : Spectre expérimental normalisé du signal de fluorescence de la molécule PpIX dont la production a été induite dans une tumeur chez un rat. Ce spectre est comparé à un spectre théorique, ce qui confirme la détection par la sonde ainsi que la validité des échantillons biologiques.
À partir des images de fluorescence obtenues (voir exemple à la Figure 3.20), il est possible d’extraire un chiffre indiquant le niveau de fluorescence. Ceci donne une indication de la concentration de PpIX contenue à cet endroit précis. Puisque la caméra EMCCD possède un niveau de précision supérieur au microscope chirurgical, ses données seront comparées à celles obtenues avec la sonde.
Figure 3.20 : À gauche, la fluorescence visible grâce au microscope chirurgical. À droite, la fluorescence telle qu’elle est visible avec le système hyperspectral. Les valeurs indiquées
représentent un ratio de l’intensité lumineuse sur la luminosité définie par la visibilité de chaque couleur. Le background est l’arrière-plan sur le tissu considéré comme n’ayant aucune concentration de PpIX.
La valeur d’intensité du pic de fluorescence maximal provenant du spectre obtenu avec la sonde est comparée à une valeur représentant l’intensité de la fluorescence de la caméra EMCCD, le tout lorsque l’excitation se fait à 405 nm. La relation entre les deux est illustrée à la Figure 3.21. Celle-ci s’explique bien par une régression linéaire (ligne pleine sur la figure), ce qui valide l’utilisation de la sonde sur des échantillons biologiques fluorescents.
Figure 3.21 : Corrélation entre la fluorescence telle que décrite par l'imagerie avec caméra EMCCD et celle obtenue avec les spectres donnés par la sonde (points). La relation est linéairement proportionnelle (ligne pleine). Tiré de [75].