Examen microscopique

Encéphale et moelle épinière

Aucune anomalie n’a été notée à l’examen microscopique de l’encéphale, ni à l’observation de la moelle épinière dans tous les segments prélevés.

Racines nerveuses

Les racines nerveuses C7, C8 et L4, L5, L6, (L7 quand elle était présente), S1, S2 ont été examinées. Un matériel myxoïde/lâche sous-périneural (autrement appelé « corps de Renaut » ; Figure 12), a été trouvé en quantité variable (tableau XIX) sur les racines C7, C8, L5, L6 et L7 de l’agneau C1 ; dans la racine L6 de l’agneau C2 et dans les racines L7 et S1 de l’agneau A4.

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Figure 12 : Corps de Renaut (Exemple de l’agneau C1).

(Figure de gauche) : HPES 100X ; (Figure de droite) : Alcian Blue 100X

(*) : Faisceau nerveux ; (barre verticale) : Hauteur du corps de Renaut ; (tête de flèche) : Périnèvre Tableau XIX. Appréciation semi-quantitative du matériel myxoïde/lâche sous-périneural (Corps de Renaut) observé dans les racines examinées à la nécropsie.

Racine C7 Racine C8 Racine L5 Racine L6 Racine L7 Racine S1

Agneau C1 (Focal) (Focal) (Focal) Léger Modéré x

Agneau C2 x x x Léger x x

Agneau A4 x x x x Discret Discret

Légende : (x) absence de matériel myxoïde/lâche sous périneural. ; (Léger) : faible épaisseur diffus sur la section ; (Focal): faible épaisseur limité à une portion du faisceau nerveux.

Lésions pulmonaires

L’agneau C2 présentait une bronchopneumonie purulente focalement extensive. La bactérie Bibersteinia trehalosi a été cultivée à partir du tissu récolté. Cet animal avait développé de la toux accompagnée de fièvre après la première anesthésie. Il a reçu un traitement anti- inflammatoire (flunixin meglumine 1,1 mg/kg IV lente; Banamine®) et antibiotique (florfenicol 20 mg/kg IM; Nuflor®). Les signes cliniques avaient rétrocédé suite au traitement.

Chez l’agneau A3, une congestion pulmonaire modérée diffuse avec léger œdème alvéolaire a été notée. L’agneau A4 présentait quant à lui, des neutrophiles principalement dans les

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glandes d'une bronche mais quelques-uns étaient aussi présents dans la lumière d'autres bronches. Enfin, l’agneau C5 présentait des lésions de bronchite/bronchiolite purulente focale, modérée.

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DISCUSSION

Il s’agit de la première description du « crampage » chez les moutons. Cette étude visait en premier lieu à caractériser cette entité en observant une série de cinq agneaux affectés et en second lieu, à préciser la localisation de la lésion à l’aide d’examens complémentaires novateurs pour l’espèce en les comparant avec cinq agneaux cliniquement normaux.

Le premier fait saillant de cette étude a été la sévérité des signes cliniques observés sur les agneaux de ce projet, comparée à ceux que nous avons observés sur le terrain. Le croisement d’individus affectés a mené à l’observation de phénotypes différents mais appartenant tout de même à une entité unique. En effet, tous présentaient la même flexion exagérée d’un ou des deux membres pelviens, sans implication des membres thoraciques et sans ataxie visible. Les anomalies de la démarche ont été notées à des degrés divers chez ces individus. En effet, pour certains, la flexion du membre affecté était très épisodique et visible uniquement lors de l’initiation du mouvement après un arrêt. Pour d’autres, elle était plus fréquente, même au repos et pouvait être soutenue et s’accompagner de tremblements des groupes musculaires cruraux lors de la flexion. À la marche, on pouvait alors constater un temps d’arrêt lorsque le membre pelvien affecté était en phase de non appui. Concomitamment, la cuisse fléchie effectuait une abduction avec une légère rotation externe. Il est à noter que la flexion anormale présentée par les animaux affectés n’a jamais été observée au reculer ou sur un animal couché. Ces différents phénotypes pourraient être le reflet d’une pénétrance incomplète du gène impliqué, donnant lieu à un continuum de signes cliniques plus ou moins marqués selon les individus. Le croisement de parents très atteints (c’est-à-dire qui présentaient l’anomalie de la démarche à chaque pas) a vraisemblablement été un facteur participant à l’aggravation du phénotype des générations F1. Il est également suspecté que l’image clinique peut varier dans le temps (processus dynamique plutôt que statique).

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Les premiers signes cliniques ont été observés lorsque les agneaux du projet étaient âgés de 2.1 à 4.5 mois. Cette période correspond non seulement au moment du sevrage mais aussi à leur période de croissance rapide. Il est possible que cet événement stressant soit un facteur déclenchant, tout comme la tonte, le transport et l’anesthésie ont été des éléments exacerbant les signes cliniques dans cette étude. L’aggravation par le stress des maladies neurologiques est un phénomène connu en médecine humaine. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour l’expliquer : son influence sur les mécanismes immunologiques via l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et le système nerveux sympathique (Buljevac D., 2003) ; l’action des glucocorticoïdes dans la cascade délétère du glutamate, dans la mobilisation du calcium et la genèse de radicaux libres ainsi que sa participation dans la compromission des défenses et de la nutrition des cellules nerveuses (Sapolsky R., 1996). La période du sevrage correspond également à une transition alimentaire vers une diète favorisant la croissance rapide. Il est intéressant de rapprocher ce fait avec la fréquence élevée de fractures vertébrales constatée aux examens d’imagerie. Des fractures ont été notées chez deux individus affectés (A4, A5) et un individu normal (C1). La fracture notée sur la pointe de la troisième vertèbre lombaire chez un agneau normal (C3) pourrait quant à elle, être compatible avec une minéralisation incomplète liée au jeune âge. Les fractures de C1, A4 et A5 impliquaient toute la première vertèbre lombaire, cependant la localisation du trait de fracture était différente (bord crânio-ventral du corps vertébral et base du processus transverse). Cette région est souvent impliquée dans les processus pathologiques puisqu’il s’agit d’une zone charnière plus vulnérable. L’individu A4 présentait également un cal osseux sur la dernière côte droite. Une alimentation inadéquate en minéraux comme le cuivre et le manganèse ou des conditions d’élevage non optimales, notamment la surpopulation dans les parquets ou la compétition entre les individus (agressions) pourraient expliquer la fréquence élevée de fracture dans la population étudiée. Compte-tenu de la régie et des contrôles réguliers de la composition de l’alimentation au CEPOQ, ces dernières hypothèses semblent peu probables. Une étude rétrospective sur des veaux a montré que la fréquence des fractures liées à une dystocie affectait à 77% la jonction thoraco-lombaire (Agerholm J., 1993). Les données péri-partum des agneaux inclus dans l’étude n’étaient pas disponibles pour interprétation. Cependant, aucune de ces fractures n’était déplacée et aucune n’avait

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d’impact sur la moelle épinière ou les racines nerveuses. Ces fractures ne sont donc pas la cause de la démarche anormale étudiée, pourtant, la prévalence des fractures chez les agneaux affectés pourrait être un marqueur-sentinelle d’un problème affectant sélectivement une catégorie d’agneaux prédisposés.

Par ailleurs, bien qu’une différence significative du nombre de globules blancs total ait été trouvée entre les groupes affectés et contrôles, il n’y avait aucune sous-population de leucocytes significativement prépondérante expliquant cette différence. Ce résultat pourrait être en lien avec la neutrophilie plus marquée de l’individu A3 (11,67x109_{) qui a pu} influencer la statistique pour l’ensemble du groupe. Cet agneau présentait aussi des lésions de pneumonie à la nécropsie. En dépit de cette différence significative, aucune des valeurs n’excédait les références dans la race ovine.

Compte tenu de la forte prévalence des maladies respiratoires chez les ovins suite à un stress physiologique (Brogden, 1998), il n’est pas surprenant de constater que 3 individus sur les 8 soumis à une nécropsie présentaient des lésions pulmonaires. De plus, la congestion et la consolidation pulmonaire rapportée pour les cas A3 et C5 pourraient également être une conséquence post-mortem de la congestion hypostatique et de l’administration de barbituriques lors de l’euthanasie. Le seul animal (agneau C2) ayant développé des signes de fièvre et de la toux avait une infection à Bibersteinia trehalosi (anciennement Pasteurella trehalosi) qui est une bactérie commensale de la flore des voies respiratoires des petits ruminants. L’infection développée était donc vraisemblablement liée à une prolifération de la flore résidente, due à l’affaiblissement du système immunitaire de l’agneau après son anesthésie.

Les examens physiques, orthopédiques et neurologiques associés aux résultats sanguins et des nécropsies supportent la conclusion que l’anomalie de la démarche est un problème isolé, qui survient chez des agneaux en bonne santé.

L’étude tomodensitométrique a permis d’établir que les animaux affectés présentaient une surface du canal vertébral à la hauteur de la deuxième vertèbre lombaire, inférieure à celle des animaux contrôles. Il n’y avait cependant pas de différence statistique

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aux autres sites mesurés (dernière vertèbre thoracique, L4, L6). Il s’agit donc d’une sténose focale de la colonne vertébrale. Pour que cette découverte soit pertinente dans la pathophysiologie de l’entité étudiée, il faut nécessairement qu’un dommage secondaire à la moelle épinière soit également présent. Dans l’espèce ovine, le renflement lombaire est contenu dans les vertèbres L4 à S1 (Rao G., 1990) ou commence en L5 (Barone, 2004) selon les auteurs. La moelle épinière se trouvant dans le corps vertébral de L2 est donc située en avant de l’intumescence sans l’inclure. Les examens microscopique et par résonance magnétique ont permis d’écarter l’hypothèse d’une lésion structurale impliquant la moelle épinière dans les régions thoracique et lombaire, incluant la région comprise dans la vertèbre L2. En outre, l’étude des ratios de l’aire de la moelle épinière sur l’aire du canal vertébral en région thoracique et lombaire, a montré qu’il n’y avait pas de différence entre les groupes. Ceci écarte l’hypothèse d’une atrophie de la moelle épinière comme élément d’explication à l’anomalie de la démarche. En confirmant qu’il n’y a pas d’implication de la matière blanche spinale, ni de processus compressif sur la moelle épinière, l’étude valide la première hypothèse que nous avions formulée. Puisque la sténose vertébrale ne semble pas avoir amené de changement secondaire sur la moelle épinière et que cette trouvaille seule ne peut expliquer la démarche des agneaux affectés, il est vraisemblable que ce rétrécissement du canal en L2 constitue un trait phénotypique qui a été sélectionné en réalisant les croisements dirigés. Cette même sélection des lignées pourrait expliquer pourquoi tous les animaux affectés partageaient des traits morphologiques tels que le caractère plus trapu et la forme de la tête, plus large. Ils étaient plus lourds que les animaux cliniquement normaux, sans toutefois que la différence de poids ou de scores corporels entre les groupes ne soient significatifs, possiblement en raison de l’écart inverse dans la paire 5.

Cette étude a également démontré que la racine spinale S2 (émergeant entre les vertèbres sacrées S2 et S3) des animaux affectés était plus petite que celle des animaux qui ne présentaient pas d’anomalie de la démarche. Par ailleurs, du matériel sous-périneural (aussi appelé « corps de Renaut »), a été observé à l’examen microscopique de plusieurs racines nerveuses, n’incluant pas nécessairement la racine S2. Il s’agit d’une structure hyaline cylindrique attachée à la face interne du périnèvre qui peut être trouvée sur des nerfs

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avec anomalies pathologiques ou normaux (Pina-Oviedo S., 2009). Ces structures semblent représenter un mécanisme de protection du nerf à un site de compression chronique (Pina- Oviedo S., 2009; Summers B., 1995). Aux sites correspondants, aucune compression nerveuse n’a été notée à l’imagerie mais une composante dynamique ne peut être exclue. Ces corps de Renaut ont été notés aussi bien chez des agneaux affectés que chez des agneaux sains, il ne semble donc pas qu’il s’agisse d’un facteur déterminant dans la pathophysiologie du « crampage ».

En revanche, la découverte de l’atrophie de la racine S2 soulève l’hypothèse nouvelle d’une anomalie fonctionnelle du nerf spinal correspondant et des nerfs périphériques dont S2 est l’une des composantes. L’anomalie pourrait concerner spécifiquement l’une ou l’autre des racines (ventrale (motrice) ou dorsale (sensitive)) ou bien les deux. Cette trouvaille place une lésion sur l’arc réflexe du membre pelvien, validant notre deuxième hypothèse.

L’arc réflexe des membres pelviens est constitué du renflement lombaire, des nerfs périphériques sensitifs et moteurs, des muscles et les fuseaux neuromusculaires correspondants. Afin de préciser plus finement la localisation de la lésion, chacun de ces segments a été évalué spécifiquement.

L’analyse du liquide céphalorachidien a permis de compléter l’examen par résonance magnétique et microscopique de la moelle épinière pour exclure une atteinte nerveuse centrale d’origine inflammatoire. Très peu d’études dans la littérature décrivent les valeurs normales pour l’analyse du liquide céphalorachidien prélevé dans la citerne cérébello- médullaire chez l’espèce ovine. Scott et al., dans leur article paru en 1991, mentionnent qu’il y a peu de différences dans la composition du liquide céphalorachidien entre les 2 sites de ponction (régions cérébello-médullaire et lombaire (Scott P., 1991). Nikitin est un des seuls chercheurs à avoir séparé clairement, chez le mouton, les résultats de LCR pris dans la citerne cérébello-médullaire, de ceux prélevés en région lombaire. Selon lui, le nombre de leucocytes varie de 0-5 cellules/μL à 1,02-11,56/ μL. Scott considère que la norme est de moins de 10 cellules/μL avec prédominance lymphocytaire pour un LCR prélevé par ponction lombaire (Scott P., 2010). La littérature rapporte également que la contamination sanguine est fréquente dans le cas des ponctions en région cérébello-médullaire, compte

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tenu de la difficulté d’accès. Il est à noter que cette problématique est vraisemblablement liée au fait que les techniques de contention utilisées étaient sous-optimales (anesthésie locale de la région atlanto-occipitale associée à une contention manuelle). Par ailleurs, la concentration en micro-protéines considérée normale dans le LCR est <0.3 g/L (Scott P., 1992; Scott P., 1995). Les résultats des agneaux de l’étude sont donc inférieurs aux normes de la littérature. Ainsi, l’absence de pléocytose et la quantité normale de micro-protéines permettent d’exclure une lésion inflammatoire du système nerveux central, incluant le renflement lombaire.

Les études de conductions avaient, quant à elle, pour but d’investiguer l’hypothèse d’une lésion nerveuse périphérique. Les résultats n’ont pas montré d’anomalie, ni de différence entre les groupes, pour l’ensemble des tests effectués. L’électromyogramme (EMG) a permis d’évaluer l’unité motrice comprenant le motoneurone, l’axone moteur et le muscle s’y rattachant. Pour pouvoir poser un diagnostic de radiculopathie à l’électromyogramme, il faut identifier une anomalie sur les muscles innervés par des nerfs différents mais ayant la racine lésée en commun dans leur constitution (Fournier E., 2013). Dans l’espèce ovine, la racine S2 participe à la constitution du nerf cutané caudal de la cuisse (qui est grêle chez les petits ruminants) et du nerf sciatique (Barone R., 2004). Le nerf sciatique se distribue aux muscles qui permettent l’extension de la hanche et la flexion du grasset avant de se diviser en 2 branches : péronière et tibiale (Pugh D., 2012). Les agneaux testés présentaient des signes cliniques depuis au moins 30 jours, avant d’être inclus dans l’étude. Cette période est suffisante pour que des lésions affectant une unité motrice musculaire soient décelables à l’électromyogramme, pourtant les muscles investigués dans notre étude, (incluant ceux innervés par le nerf sciatique), n’ont pas montré d’anomalie significative à l’électromyogramme. De plus, l’évaluation des fibres musculaires en microscopie optique était également normale. Cette étude a donc montré que l’appellation « crampage », qui renvoie à une dysfonction musculaire, est inexacte.

Bien que l’EMG soit une technique spécifique pour diagnostiquer une radiculopathie, il est peu sensible et n’évalue pas la portion sensitive du nerf. En effet, le résultat peut être normal

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dans le cas d’une atteinte sensitive pure (avec une atteinte nerveuse proximale au ganglion de la racine dorsale), ou d’une atteinte partielle de la racine nerveuse motrice (la démyélinisation ou la lésion de quelques axones n’apparaissent pas à l’EMG), ou encore si la dénervation est compensée par la ré-innervation (la fibrillation n’étant pas observée dans ce cas particulier) (Barr K., 2013). En considérant l’hypothèse d’une atteinte de la racine sensitive seulement, la combinaison de douleurs référées et d’une altération de la sensibilité de l’extrémité digitée pourrait amener à une modification de la démarche. L’absence d’anomalie lors des tests électrodiagnostiques, n’élimine pas complètement la possibilité d’une atteinte sensitive altérant la démarche. En effet, la médecine humaine décrit des syndromes mono-radiculaires dans la région lombo-sacrée conduisant à des cruralgies irradiant sur le territoire d’innervation de la racine concernée, dont la cause sous-jacente n’est souvent pas identifiée.24

L’intégrité des axones et de la gaine de myéline des nerfs périphériques a été testée en mesurant les vitesses de conduction nerveuses et sensitives. Les vitesses comparables entre les groupes permettent d’écarter l’hypothèse d’une démyélinisation des axones à conduction rapide ou d’une perte significative du nombre d’axones sur les nerfs périphériques testés. Une démyélinisation ou une dégénérescence axonale a non seulement pour effet de diminuer la conduction nerveuse mesurée, mais peut également modifier la forme de la courbe obtenue en causant une dispersion temporelle des Potentiels d’Action Musculaires Composés (PAMC). L’évaluation des PAUM a été difficile à réaliser en l’absence d’élément de comparaison dans la littérature puisque l’article de Steiss et al. ne montre aucune figure représentant leurs courbes. Par ailleurs, avec les tracés obtenus dans notre recherche, il était difficile d’établir une unité dans la forme des PAUM pour chaque nerf. Il est donc délicat de discuter de la dispersion temporelle du signal (correspondant à un élargissement de la courbe normale, une allure irrégulière ainsi qu’une diminution de l’amplitude de la courbe). Les amplitudes quant à elles étaient très variables au sein des groupes, selon le site de

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stimulation. Une amplitude plus faible était obtenue lorsque les aiguilles de stimulation étaient placées plus loin du nerf testé.

En raison de l’utilisation de techniques nouvelles ou succinctement décrites chez le mouton, nous avons utilisé les montages électrodiagnostiques employés chez les carnivores domestiques ou le cheval lorsque la littérature était disponible, et les avons transposés dans l’espèce ovine. Il est à noter que dans cette espèce, les muscles sous l’articulation du jarret ne peuvent être utilisés car ils sont très grêles ou inexistants. Les muscles interosseux, utilisés chez les carnivores domestiques en électrodiagnostic, n’ont délibérément pas été employés dans cette étude, en raison de leur présence inconstante chez le mouton. En effet, ce muscle existe sous l’aspect d’une fine bande charnue chez les jeunes agneaux et devient entièrement fibreux avec la maturation (Dyce K., 1996). Lorsque le muscle se fibrose, il ne peut plus être utilisé à des fins de mesure des conductions nerveuses. Les électrodes qui devaient être insérées dans ces muscles ont été déplacées dans des groupes musculaires recevant la même innervation, mais placés proximalement à l’articulation tibio-tarsienne. Il est recommandé d’avoir une distance inter électrode d’au-moins 10 cm, pour avoir une valeur de conduction nerveuse représentative (Cuddon P., 2010). Cela a été le cas pour la plupart des vitesses de conductions motrices, mais rarement pour les vitesses de conduction sensitives. La difficulté à obtenir la distance minimale souhaitée résidait dans la courte longueur des membres chez ces agneaux et l’absence de muscles distaux au jarret. En utilisant un protocole pour les VCNM similaire au nôtre sur des moutons adultes, Steiss et al., donnaient des valeurs de 76.3 +/- 12.5 ms-1 _{pour le nerf radial, de 103.9 +/- 12.7 ms}-1 pour le nerf péronier et de 98.6 +/- 13.1 ms-1 _{pour le nerf tibial (Steiss J., 1987) alors que} dans la présente étude, les vitesses moyennes obtenues étaient pour le nerf radial de 159,06 ms-1 _{(groupe A) et 150,45 (groupe C) ; pour le nerf péronier de 133,42 ms}-1 _{(groupe A) et} 106,51 ms-1 _{(groupe C) ; pour le nerf tibial de 156,85 ms}-1 _{(groupe A) et 162,28 ms}-1 _(groupe C). Même si nos montages étaient similaires, les distances entre les électrodes de stimulation et les paramètres du programme d’exploitation informatique employé par Steiss et al. n’étaient pas rapportés dans leur article, ce qui ne permet pas une comparaison objective. Ainsi, une différence de réglage ou une plus grande distance inter électrode pourrait expliquer l’écart entre ces résultats.

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Les tracés obtenus pour les conductions nerveuses étaient répétables et convaincants, cependant la ligne de base a été difficile à déterminer puisqu’elle était rarement lisse et horizontale en raison du mouvement du membre lié à la stimulation nerveuse. Ainsi, le positionnement manuel des curseurs s’est également avéré plus délicat qu’escompté. La technique d’évaluation jugée la plus proche de la réalité, a été obtenue en analysant ensemble les différents essais (appelés « runs ») pour avoir une idée globale de la forme des courbes. Ceci a amené à placer le curseur sur une déflection qui n’était pas obligatoirement la première, mais qui correspondait le plus probablement au début réel de la courbe. C’est