6/ Sensibilité des entérobactéries aux β-lactamines:
4. Diagnostic bactériologique des infections urinaires:
4.1. Examen macroscopique :
L’identification des souches bactériennes doit être systématiquement accompagnée d’un antibiogramme. Ces deux méthodes phénotypiques sont ensuite complétées par une recherche approfondie par biologie moléculaire des souches isolées afin caractériser les gènes producteurs des BLSE.
4.1. Examen macroscopique :
Aspect de l’urine: clair, trouble, Hématique, etc; Culot: nul, faible, moyen, important;
-72- 4.2. Examen à l’état frais :
L’urine est examinée à l’état frais sur une cellule de mallassez et on note au microscope entre autres:
- Le nombre de leucocytes; - Le nombre d’hématies;
- Présence ou absence des cristaux (oxalate de Ca2+, …); - Présence ou absence des cellules (épithéliales, vésicales...); - Présence ou absence des levures;
- Présence ou absence des bactéries; - Autres.
4.3. Culture:
Afin d’obtenir des colonies bien isolées des entérobactéries uropathogènes, les échantillons urinaires ont été ensemencées sur un milieu de culture gélosé ordinaire: Le CLED (cysteine lactose electrolyte deficient) ou le BCP (Pourpre de Bromocrésol). Les boites de pétri ensemencées ont été par la suite incubées à l’étuve pendant 18 à 24 heures à 37°C. Plusieurs caractères peuvent être étudiés pour l’identification des germes bactériens isolés dont les principaux sont: la taille, l’aspect et le contour des colonies. Par exemple :
- Les souches d’E. coli donnent sur le milieu CLED de grosses colonies, lactose positif et à contours irréguliers.
- Les souches de K. pneumoniae donnent sur le milieu CLED de grosses colonies muqueuses, lactose positif et ayant une tendance à la confluence.
Lors de l’examen macroscopique, le nombre de bactéries sur boites de pétri est évalué par un dénombrement des germes urinaires (DGU) qui est exprimé en Unité Formant Colonie « UFC »/ml.
Coloration de Gram:
La coloration de Gram est réalisée à partir de la culture afin d’étudier les caractères morphologiques de la bactérie étudiée, notamment la forme (ex. Cocci ou Bacille) et aussi distinguer entre les bactéries à gram négatif et les bactéries à Gram positif. Sur le Gram, les entérobactéries apparaissent sous la forme de bacilles colorés en rose.
-73- La réaction à l’oxydase:
Le test à l’oxydase est réalisé à l’aide d’un disque de Tetramethyl-p-phénylènediamine, imprégné d’eau distillée sur lequel a été déposée une colonie. La réaction positive à l’oxydase se traduit par l’apparition d’une coloration violette à l’endroit où la colonie a été déposée. Les entérobactéries comme Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae sont dépourvues d’oxydase.
4.4. Identification des entérobactéries uropathogènes:
Après ensemencement sur milieux gélosés et la coloration de Gram, les souches sont identifiées selon les méthodes en usage au laboratoire. Ces méthodes peuvent être classiques (utilisation des galeries biochimiques API 20E) ou automatisées. La galerie biochimique API20E se compose de 20 microtubes contenant des substrats déshydratés pour la mise en évidence d’enzymes ou de fermentation de sucres (Figure 13). Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d’une culture pure, qui réhydrate les substrats. Les réactions produites durant la période d’incubation se traduisent par un changement spontané ou révélé par l’addition de réactifs. La fermentation des carbohydrates entraîne une acidification se traduisant par un virage spontané de l’indicateur coloré.
Figure 13: Galerie API 20E identifiant K. pneumoniae.
Pour cette étude, l’identification des bactéries a été réalisée par méthode automatisée sur Microscan Walkaway® (Dade Behring®, Sacramento, Etats-Unis) (Figure 14). Les bactéries peuvent être identifiées selon le type de réactions biochimiques qu’elles produisent.
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Figure 14: Photo de l’automate Microscan WalkAway®.
La plaque 96 puits combo (Figure 15) dispose d’un nombre important de tests qui permet l’identification de l’espèce bactérienne ainsi que la détermination de son profil de résistance aux différents antibiotiques testés. Elle peut être subdivisée en deux principales parties :
- La partie pour l’identification de l’espèce bactérienne: Les cupules de cette partie sont constituées de substrats qui définissent les caractères biochimiques de la bactérie étudiée. Elles permettent ainsi l’identification de l’espèce bactérienne responsable de l’infection.
- la partie antibiogramme: Les cupules de cette partie se composent d’un nombre d’antibiotiques à différentes concentrations permettant la détermination des CMI pour les antibiotiques testés. La croissance bactérienne se traduit par une augmentation de la turbidité qui est évaluée par l’automate.
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Figure 15: Plaque 96 puits pour identification et antibiogramme utilisé par l’automate Microscan WalkAway®.
Mode opératoire (Figure 16):
Réalisation de l’inoculum bactérien: Une attention particulière devrait être prêtée à la préparation de l’inoculum. La suspension bactérienne est obtenue, à partir d’une souche pure, en piquant trois colonies bien isolées sans contact avec la gélose grâce à une pointe calibrée Prompt® dans un milieu de suspension « flacon Prompt » suivie d’une agitation. Cette technologie prompt®, grâce à sa pointe calibrée, permet de standardiser l’inoculum rapidement et sans ajustement de la concentration par turbidimétrie.
Inoculation de la plaque Microscan®: Elle est réalisée par la technologie Renok® qui permet d’ d’inoculer et de réhydrater les plaques MicroScan® de façon simple et rapide en une seule étape.
Incubation des plaques: Les plaques sont ensuite incubées dans le système WalkAway® pendant au moins 16 heures à 35°C.
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Figure 16: les différentes étapes pour l’identification des souches bactériennes par l’automate Microscan WalkAway®.
Lecture des plaques: Les plaques sont lues sur les instruments Microscan®.
4.5. Mesure de la sensibilité aux antibiotiques des entérobactéries:
L’antibiogramme est l’examen biologique destiné à tester la sensibilité d’une souche bactérienne vis-à-vis d’un ou de plusieurs antibiotiques. Cet examen consiste à placer la souche bactérienne étudiée en présence d’un antibiotique et à observer l’effet de ce dernier sur le développement de la souche bactérienne étudiée. Il existe principalement trois types d’interprétation selon le résultat obtenu:
- Souche bactérienne sensible (S): souches pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutiques est forte dans le cadre d’un traitement classique avec posologie recommandée.
- Souche bactérienne intermédiaire (I): souches pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Les souches bactériennes intermédiaires ont été groupées avec les souches résistantes pour l’ensemble des analyses.
- Souche résistante (R): souches pour lesquelles il existe une forte probabilité d’échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d’antibiotique. La résistance des bactéries isolées aux antibiotiques est déterminée selon la formule suivante:
-77- % de résistance =
Pour cette étude, la sensibilité aux antibiotiques a été déterminée par la méthode automatisée sur Microscan Walkaway (Dade Behring®, Sacramento, Etats-Unis) selon les normes du Comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie (CA-SFM) [108].
La sensibilité in vitro d’un antibiotique donné est un des pré-requis pour l’efficacité in vivo d’un traitement antibiotique.
La méthode automatisée pour la détermination de l’antibiogramme permet la détermination des CMI exactes des différents antibiotiques testés par microdilution en méthode liquide (Figure 17).
Figure 17: Détermination de la CMI de l’antibiotique par microdilution en milieu liquide employée par l’automate Microscan wallaway®.
4.6. Détection du phénotype BLSE par des techniques microbiologiques: