LISTE DES TABLEAUX
II. MATERIELS ET METHODES
IV.5 Méthodes diagnostiques des candiduries
IV.5.1 Diagnostic mycologique
IV.5.1.2 Examen direct
L’examen direct (ED), première étape au laboratoire, permet d’orienter rapidement le diagnostic et éventuellement la thérapeutique. Il ne comporte que la réalisation d’un état frais examiné au microscope(7, 51)et consiste à la recherche des levures bourgeonnantes associées ou non à des pseudofilaments.
Cet examen se fait directement sur une goutte d’urine déposée entre lame et lamelle et observée au microscope optique. L’urine peut être également
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Il est pratiqué directement, après humidification de l’écouvillon avec l’eau physiologique stérile, une goutte est déposée entre lame et lamelle pour l’observation au microscope optique. Pour l’examen direct des hémocultures, un frottis est réalisé puis coloré au Giemsa, les levures apparaissent colorées en bleu violet.
IV.5.1.3 Culture
L’ensemencement se fait habituellement sur milieu Sabouraud–chloramphénicol avec et sans actidione. L’incubation se fait à 37 °C. La lecture se fait au bout de 24 à 48 heures. L’examen macroscopique des cultures montrera des colonies blanchâtres, humides de surface lisse et brillante, ou plus rarement, croûteuse, terne, sèche, mate, ou ridée. Les associations sont difficilement détectables(51).
IV.5.1.4 Identification
a) Identification de C. albicans :(51)
Candida albicans est l’espèce la plus fréquemment isolée, son identification
repose sur des tests morphologiques et biochimiques.
Test de filamentaion sur sérum ou test de blastèse : Il consiste à réaliser une suspension de levures dans du sérum de lapin et l’incuber à 37 °C pendant trois heures. C. albicans est alors identifié par la production d’un mince tube germinatif de diamètre homogène sans constriction à sa base émergeant de la cellule mère. Ce test a longtemps était considéré comme méthode de référence du fait que sa spécificité et sa sensibilité sont respectivement de 100 % et de 86,3 %. De nombreux paramètres (expérience de l’observateur, charge de l’inoculum, pH,..) peuvent affecter le résultat du test de blastèse. Ses principaux inconvénients sont l’impossibilité de détection des éventuelles associations dans deux tiers des cas(52)et la capacité de certaines espèces à produire des « tubes
germinatifs - like ». De plus C. dubliniensis est également capable de produire des tubes germinatifs, raison pour laquelle il a été longtemps confondu avec C.
albicans.
Test de chlamydosporulation : Il repose sur une sub-culture de 24 à 48h à 25-28°C de l’isolat en strie profonde dans un milieu PCB (pomme de terre, carotte, bile) ou RAT (riz, agar, tween 80). La présence de chlamydospores terminales qui sont des structures arrondies, à paroi épaisse (aspect de double contour), produites isolément ou en grappe à l’extrémité du pseudomycélium, mesurant environ 10 à 15 µm, est caractéristique de l’espèce C. albicans(51).
Tests métaboliques : Murex C. albicans® (Murex Diagnostics), Albicans-Sure® (Clinical Standards Laboratories) et BactiCard Candida® (Remel CO) : Ces tests biochimiques consistent en la recherche d’une double activité β-galactosaminidase et L-proline aminopeptidase, positive pour les seules colonies de C. albicans. Les autres espèces peuvent présenter l’une ou l’autre des deux activités, mais pas les deux associées. Le premier dispositif donne un résultat en 30 minutes et repose sur un principe de colorimétrie, tandis que pour les deux autres tests, la révélation de l’activité β-galactosaminidaseobservable en quelques minutes utilise un substrat couplé à un dérivé de l’umbelliferone et nécessite un dispositif de lecture de la fluorescence émise (lampe de Wood)(51).
b) Identification des autres espèces :
Milieux de primo-isolement : Les milieux de primo-isolement permettent à la fois l’isolement et l’identification des espèces de Candida. Ce sont des milieux chromogènes ou fluorogènes selon les substrats utilisés, grâce à quoi une réaction colorée ou fluorescente particulière est attribuée aux colonies qui s’y
64 Différents kits sont commercialisés, on citera :
o Candida ID® (BioMérieux) : Les colonies de C. albicans se colorent en bleu alors que celles de C. tropicalis, C. kefyr et de C. lusitaniae se colorent en rose(51).
o CHROMagarCandida® (Becton-Dickinson) : Les colonies de C. albicans sont vertes, ceux de C. tropicalis sont en bleu métallique et les colonies de
C. krusei sont d’un rose pâle. Ce milieu présente le spectre le plus large
pour l’identification directe des colonies(51).
o Candi Select®BioRad : Les colonies de C. albicans sont rose-violettes. Les espèces C. tropicalis, C. glabrata et C. krusei forment des colonies bleues d’aspect différent(51).
Ces milieux chromogènes permettent l’identification sélectif de C. albicans, et présomptif de C. glabrata, C. krusei et C tropicalis. L’identification formelle des autres espèces nécessite des tests complémentaires(51).
o Fluoroplate® Candida (Merck) : Cultivées sur ce milieu fluorogénique, les colonies de C. albicans présentent une fluorescence bleutée sans diffusion du pigment dans la gélose, lorsqu’elles sont observées sous lumière ultraviolette à 366 nm. La nécessité d’un équipement spécifique limite l’utilisation de ce milieu.
Etude de l’assimilation des sucres : Dans l’éventualité où l’aspect et la coloration de la colonie ne permettent pas une identification précise de l’espèce, ou encore lorsque les tests rapides spécifiques s’avèrent négatifs, l’identification de la levure nécessite alors l’utilisation de galeries. Ces derniers reposent sur
l’étude de l’assimilation des carbohydrates (auxanogramme) et de leur fermentation (zymogramme)(51).
Parmi les galeries commercialisées les plus utilisées nous citerons : API 20C Aux, ID 32 C,
Auxacolor, Fungichrom(51).
o API 20C Aux (BioMérieux) : elle est fondée sur l’assimilation de 19 sucres différents et permet d’identifier 43 levures différentes.
o ID 32C (BioMérieux) : elle comporte une étude de l’assimilation de 29 sucres et de la résistance à l’actidione ainsi qu’un test à l’esculine. Soixante-trois levures différentes sont référencées.
Ces deux galeries donnent un résultat en 48 à 72 heures. La croissance de la levure se traduit par une opacité de la cupule contenant le sucre(50, 51).
Tests enzymatiques : le Fongiscreen 4H (BioRad) permet d’identifier en quatre heures les quatre levures les plus pathogènes et les plus fréquentes :
C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata et Cryptococcusneoformans. Cette
méthode est fondée sur la recherche de cinq enzymes spécifiques, la réduction du tétrazolium et l’assimilation du tréhalose. Ce test a une sensibilité de 93,6 % et une spécificité de 98,7 %.
Kruseicolor® test (Fumouze) : c’est un test immunologique, réalisé à partir de colonies isolées, fondé sur l’agglutination des particules de latex, réalisé en quelques minutes et permet d’identifier spécifiquement C. krusei(51, 53). Glabrata RTT® (Fumouze Diagnostics) : Les colonies de C. glabrata sont
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résultat est obtenu en 15 minutes(51). Il est caractérisé par une très bonne sensibilité comprise entre 95,8 et 98,4 % et une excellente spécificité variant de 98,9% à 100 %(54).