2.2.1 Ex vivo : artères mésentériques, artères coronaires et aortes

(Ces expériences ont été réalisées pour les études sur les artères mésentériques, en

collaboration avec l’équipe du Dr Daniel Henrion (CNRS UMR 6188, Angers, France), pour celles sur les artères coronaires, en collaboration avec l’équipe du Dr Vincent Richard (Inserm U644, Rouen, France), et pour les études sur l’aorte, par Violaine Griol- Charhbili, au laboratoire).

Un des objectifs de ma thèse a été de caractériser les altérations de la réactivité vasculaire dans notre modèle de surexpression conditionnel du RM dans l’endothélium. Les paramètres explorés sont des paramètres fonctionnels, tels que l'étude de la réactivité des cellules musculaires lisses (réponse aux agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs endothélium-indépendants), et des cellules endothéliales (réponse aux agents vasodilatateurs endothélium-dépendants). Ces paramètres ont été déterminés grâce à un myographe (Mulvany et Halpern, 1977). Cet appareil permet de mesurer la réactivité vasculaire soit passive (relation pression-diamètre), soit active (réponse aux agents vasoconstricteurs) d'un segment isolé dans une chambre d'organe. Cette

technique n'est applicable que pour des artérioles ou artères de petit calibre (< 1 mm de diamètre).

Deux fils en tungstène inextensibles sont passés dans la lumière du vaisseau permettant de soumettre ce dernier à différentes forces d'étirement et de mesurer les forces ou tensions générées par le segment artériel étudié. Pour l'étude des propriétés fonctionnelles, le vaisseau est placé dans des conditions isométriques c'est-à-dire que les forces développées par le vaisseau en réponse aux agents contractants ou relaxants sont mesurées à un diamètre interne donné.

Cette technique présente néanmoins quelques limites : 1) le dommage traumatique inégal de l'endothélium par le passage du fil métallique doit être considéré, mais il paraît négligeable ; 2) le segment artériel dans le myographe est soumis à des forces parallèles au plan de la média alors que ces forces sont radiales lorsque le vaisseau est soumis in vivo à une pression de distension physiologique ; 3) le segment artériel n'est pas perfusé, or le débit via l'endothélium peut influencer la réactivité vasculaire.

Prélèvements: sous loupe binoculaire, l'artère coronaire septale et l'artère mésentérique de troisième ordre sont délicatement isolées et nettoyées des adhérences graisseuses et des tissus adjacents. Les vaisseaux étudiés (cœur, aorte et une partie du mésentère) sont immédiatement placés après prélèvement dans une solution de Krebs glacée et oxygénée dont la composition est la suivante (en mmol/L) : NaCl 118.3, KCL 4.7, CaCl2 2.7, NaHCO3 25, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, glucose 5.

Montage des vaisseaux sur le myographe de Mulvany: une fois isolée, chaque artère (2 mm de long) est transférée dans le myographe (Modèle 400A, JP Trading, Aarhus, Danemark), comprenant une cuve avec deux mâchoires remplie de la solution de Krebs oxygénée par le mélange 95% O2 + 5% CO2 (pH 7.4). Chaque segment artériel est attaché à l'aide de 2 fils inextensibles en tungstène (de diamètre différent selon le segment d’artère considéré) passés dans la lumière du vaisseau, et pour l'autre à une jauge de contrainte permettant d'enregistrer la tension isovolumétrique développée par le vaisseau. La disposition générale de la préparation est illustrée Figure IV-3. Le montage du vaisseau dans le myographe s'effectue également sous une loupe

binoculaire. Après le montage, une période de repos dans le myographe de 45 min est respectée pendant laquelle la température du myographe se stabilise à 37°C.

Etablissement des conditions de mesure optimales: les réponses contractiles aux divers agonistes d'une artère dépendent soit de son degré d'étirement soit, à longueur constante, de son diamètre interne. Ainsi, les conditions de tension basale imposée au vaisseau, ou du diamètre interne normalisé, doivent préalablement être définies pour chaque type d'artère. Le diamètre d'un vaisseau dépend de la structure de sa paroi et de la pression transmurale.

Réalisation des courbes concentration-réponse: l’étude de la réactivité vasculaire est réalisée en exposant le vaisseau à des concentrations croissantes d’agents vasoactifs administrés dans la cuve du myographe remplie de liquide physiologique. A chaque concentration correspond une force exercée par le vaisseau, lue sur l’enregistreur. Une période minimale de repos de 20 minutes est respectée entre chaque courbe.

Afin d'étudier la relaxation endothélium-dépendante, nous avons choisi d'utiliser l'acétylcholine (Ach) qui est l'agent pharmacologique le plus souvent utilisé pour étudier les réponses endothélium-dépendantes sur ces artères (maximum de relaxation en réponse à l'acétylcholine (10-5M)).

Les réponses relaxantes de l'artère coronaire ont été évaluées après précontraction de l'artère par la sérotonine (5-HT) à la concentration submaximale (~3.10-6 M). Une courbe de relaxation endothélium-dépendante en réponse à des concentrations croissantes d'acétylcholine (Ach, 3.10-9-10-5 M) et une courbe de relaxation endothélium- indépendante, en réponse à des concentrations croissantes de nitroprussiate de sodium (NPS, 3.10-9-10-5 M) ont été déterminées sur chaque segment artériel.

Les réponses relaxantes de l'artère mésentérique ont été évaluées après précontraction de l'artère par le KCl (60 mM). Une courbe de relaxation endothélium-dépendante, en réponse à des concentrations croissantes d'Ach, de bradykinine (10-9-10-5 M) et une courbe de relaxation endothélium-indépendante en réponse à des concentrations croissantes de nitroprussiate de sodium (NPS, 10-8 à 3.10-5 M) ont été déterminées sur chaque segment artériel.

Les valeurs de relaxation obtenues sur chaque artère ont été exprimées en pourcentage de relaxation par rapport à la précontraction initiale induite par la 5-HT ou la

PhénylEphrine.

Afin d'étudier l'implication du monoxyde d'azote (NO) dans la relaxation endothélium- dépendante à l'Ach des artères coronaire et mésentérique de souris, nous avons utilisé comme inhibiteur de la NO synthase, respectivement la L-nitro-arginine (LNNA), et le L- NAME. La dose utilisée a été de 10-4 M, qui est une dose suffisante pour entraîner un blocage complet de la NOS endothéliale (Richard et al, 1994 ; Varin et al, 1999).

Dans le but de déterminer le niveau d’implication des canaux SKCa, IKCa et BKCa dans les relaxations NO indépendantes en réponse à l’Ach, la réactivité aortique est mesurée après pré-incubation pendant 30 minutes avec des bloqueurs spécifiques de ces canaux, la charybdotoxine (Chbtx), l’apamine et l’ibériotoxine (Ibtx) à la concentration de 10-7 M.

Entre 2 courbes concentration-réponse, avant une éventuelle incubation avec un agent pharmacologique, le vaisseau est rincé plusieurs fois avec la solution physiologique de Krebs oxygénée et maintenue à 37°C.

Tous les agents pharmacologiques utilisés pour les tests in vitro ont été fournis par Sigma, France, sauf indiqué spécifiquement.

Souris VEcadh-tetOFF/tetO-hRM Isolation des artères mésentériques dites de « résistance » Loupe binoculaire 1 mm 180-210 µm 1 mm 180-210 µm Myographe

Fig IV.3 Principe du myographe.

(Mulvany et Halpern, 1977)

L’appareil de myographe permet d’enregistrer des variations de tensions isométriques de segments d’artères. Il permet ainsi de mesurer la réactivité vasculaire soit passive (relation pression-diamètre), soit active (réponse aux agents vasoconstricteurs) d'un segment isolé dans une chambre d'organe.