Evaluation des PCRs et PCR RFLPs appliqués sur des lames archivés 108 

5.1. Evaluation des ADNs extraits par la PCR PO

Nous avons procédeé à l’application de la PCR PO sur tous les ADNs extraits des lames archivés avant toute PCR afin de s’assurer de l’absence de toute inhibition possible (Photo 20). Ainsi, cette PCR a été appliquée pour les échantillons d’ADN provennants de tous nos 86 patients (66 échantillons de la LC et 20 échantillons de la LV). La photo ci-après est un example du résultat obtenu : ici, 4 échantillons sont négatifs.

109

Photo 20. Résultats de la PCR PO sur de l’ADN de lames archivées.

MT : marqueur de taille (l00 pb); T+ : contrôle positif ADN canin (LN80); T-: témoin négatif.

5.2. Evaluation de la PCR ITS1 sur des ADN parasitaires extraits de lames de patients

5.2.1. PCR ITS1

En fait, une amplification par PCR de la région ITS1 (Photo 21) a été réalisée pour 66 patients atteints de la LC et 20 patients atteints de la LV (Annexe VII). Les 86 patients recrutés au CHU d’Annaba ont été diagnostiqués par examen direct à la recherche de corps de

Leishmania sp.

Ainsi, au moins une lame contenant les parasites étalés est disponible pour chaque patient. A partir de ces lames, l’ADN des parasites a été extrait par la méthode du Phénol/Chloroforme. Afin d’améliorer les signaux faibles et essayer d’avoir un signal positif pour les isolats qui n’ont pas pu être amplifié, une deuxième ou troisième amplification a été effectuée en utilisant comme cible l’ADN extrait à partir d’autres lames du même patient (en cas de disponibilité). Tous les échantillons avec de résultats négatifs ont été amplifiés par la 2ème _{et éventuellement}

la 3ème _PCR.

Sur les 86 échantillons, 79 (91,86%) isolats ont donné un résultat positif, alors que les 7 (8,14%) autres n’ont pas donné un signal (résultat négatif) (Tableau 62). Cette difficulté

110

d’amplification est probablement due à la présence d’inhibiteurs qui ont persisté pendant les étapes d’extraction d’ADN ou tout simplement à l’état de l’ADN qui est dégradé.

Photo 21. Résultats de la PCR ITS1 sur de l’ADN de lames archivées.

MT : marqueur de taille (l00 pb), Souches de références : L. infantum: LV50, L. major: Ronl14, L. tropica : Bag 9.

5.2.2. Identification des espèces de Leishmania à partir des patients par PCR-RFLP ITS1

Afin d’identifier l’espèce du parasite en question, les produits PCR ITS1 qui ont été trouvé positifs ont été digérés par l’enzyme de restriction HaelII. Des échantillons représentant les souches de références de l’Ancien Monde ont été inclus afin de faciliter l’identification des espèces par comparaison du profil de digestion avec celles-ci.

L’électrophorèse des produits de digestion (Photo 22) a montré des profils de restrictions différents : 19 échantillons montrent un profil de restriction concordant avec celui de la souche de référence L. major, alors que 36 échantillons de LC et 12 échantillons de LV montrent un profil de restriction comme celui du complexe L. donovani identique avec le profil de l’espèce

L. infantum. Uniquement 1 échantillon a présenté un profil identique à l’espèce L. tropica. Deux

échantillons de LC se sont révélés faiblement positifs en PCR, c’est pourquoi nous avons eu des difficultés à visualiser leur profil de restriction ce qui nous donne un résultat non- interprétable.

111

Photo 22. Résultat de la PCR-RFLP après la digestion avec l’enzyme de restriction HaelII.

M : marqueur de taille l00pb; L. infantum : LV50; L. major : Ronl14; L. tropica : Bag 9.

5.3. Evaluation de la PCR mini-exon sur les échantillons prélevés de patients 5.3.1. PCR mini-exon

Dans cette partie du travail, nous nous sommes intéressées à la détection et l’identification du parasite Leishmania chez des patients atteints de la leishmaniose, par la PCR mini-exon. Pour ce faire, nous avons appliqué la PCR mini-exon (Photo 23) pour détecter la présence du parasite et ensuite en digérant le produit amplifié par l’enzyme de restriction Eael pour déterminer avec précision l’espèce responsable.

Ainsi, les ADNs extrait de lames archivés précieuses correspondant à des patients atteints de leishmaniose ont été utilisé pour une amplification utilisant les amorces spécifique du gène mini-exon. Dans le cas où aucune amplification n’est obtenue, une deuxième voir une troisième amplification utilisant un autre extrait d’ADN parasitaire provenant du même patient a été réalisé. Ceci a été fait dans le but d’augmenter les chances d’obtenir une amplification et contourner les problèmes d’inhibitions.

Sur les 86 échantillons prélevés de patients, 62 échantillons (72,09%) ont été trouvés positifs après amplification (Tableau 62).

112

Photo 23. Résultats de la PCR mini-exon sur de l’ADN de lames archivées.

MT : marqueur de taille (l00 pb), Souches de références : L. infantum: LV50, L. major: Ronl14, L. tropica : Bag 9.

5.3.2. Identification des espèces Leishmania prélèvent des patients par PCR-RFLP mini-exon

Pour pouvoir identifier les espèces Leishmania à partir des lames archivées provenant de patients atteints de leishmaniose, les produits PCR qui ont montré des signaux positifs ont été digérés avec l’enzyme de restriction Eael. De plus, pour pouvoir comparer les profils et identifier l’espèce, différents isolats de cultures correspondants aux espèces de références de l’Ancien Monde ont été ajouté à chaque expérience.

Concernant les échantillons de la LC, l’électrophorèse des produits de digestion a montré que 33 échantillons correspondent à l’espèce L. infantum, alors que 14 échantillons sont du L.

major. Alors qu’un seul échantillon a montré un profil de restriction comme celui de l’espèce L. tropica. La visualisation du profil de digestion de 3 échantillons s’est avérée impossible

(Tableau 66).

Pour les patients de la LV, les échantillons positifs en PCR ont aussi subit une digestion enzymatique avec l’enzyme Eael, de même que les souches de références, afin de pouvoir identifier l’espèce en question. Le résultat de digestion a montré que les échantillons possèdent un profil de digestion comme celui de l’espèce L. infantum (Photo 24).

113

Ces résultats sont retrouvés en concordance avec ceux obtenus par PCR-RFLP ITS1, réalisée dans la partie précédente de ce travail.

Photo 24. Résultats de la PCR mini-exon RFLP Eael sur de l’ADN de lames archivées.

MT : marqueur de taille l00 pb et 50pb, Souches de références : L. infantum: LV50, L. major: Ronl14, L. tropica : Bag 9.