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Lors des phases de tests, les performances des animaux peuvent être influencées par divers critères, comme le niveau d’éveil ou l’état de vigilance au cours de la journée. Pour limiter leur impact, les tests comportementaux sont toujours effectués lors de la phase diurne sur un créneau horaire le plus réduit possible, en général entre 9 heures et 13 heures. De plus, l’ordre de passage des animaux est modifié chaque jour de manière à randomiser l’heure de passage et, ainsi, lisser d’éventuelles variations des performances liées au cycle nycthéméral.

Figure 30 : Chirurgie stéréotaxique : lésion excitotoxique des noyaux ReRh du thalamus. Photographies d’une chirurgie (réalisées au laboratoire) avec mise en évidence des repères stéréotaxiques Bregma et Lamba (A) et de l’angle utilisé (B). Représentation schématique des 3 points d’instillation et de leurs coordonnées selon l’atlas de Paxinos et Watson 2007 (C). Adapté de la thèse de Thibault Cholvin.

3.1. Principe

La piscine de Morris ou « Morris Water Maze » (MWM) a été inventée par Richard Morris en 1981 et se base sur le comportement naturel des rats à fuir l’eau fraîche (Morris, 1984). En effet, l’eau fraîche (21 °C ± 1 °C) est un milieu aversif pour l’animal qui va chercher une échappatoire. C’est un test de mémoire spatiale conçut pour évaluer la capacité des rats à se construire une représentation mentale de leur environnement (i.e. carte cognitive : Tolman, 1948 ; O’Keefe et Nadel, 1978). L’objectif des rats est donc d’apprendre l’emplacement fixe de cette échappatoire qui se présente sous forme d’une plateforme (toujours identique). Comme le bassin lui-même ne comporte pas de repères, l'animal calcule la trajectoire à prendre pour rejoindre la plate-forme en utilisant les indices visuels spatiaux

distaux présents dans la pièce. Ces informations visuelles sont dites allocentriques. Ce terme

fait référence au fait que la source des informations spatiales est purement externe (objets environnants), par opposition aux informations égocentriques. Par la répétition des séances d’acquisition, ce test permet d’évaluer la mémoire de référence, c’est-à-dire la mémoire de l’emplacement de cette plateforme au sein de l’environnement. Cette mémoire comprend également les règles et procédures à mettre en œuvre dans une situation donnée pour y répondre de manière adaptée. Dans notre cas, un apprentissage se traduira par une diminution

progressive du temps ou de la distance d’accès à la plate-forme avec la répétition des essais

et des jours de test.

3.2. Dispositif

La piscine de Morris est un dispositif circulaire en PVC blanc d’un diamètre de 160 cm et d’une hauteur de 60 cm, virtuellement découpée en quatre quadrants égaux, Figure 31A. Cette dernière est remplie à mi-hauteur (soit près de 660 litres) d’eau opacifiée à l’aide de lait en poudre (600g environ). La couleur de l’eau ainsi obtenue (blanc et opaque) tout comme la transparence de la plateforme permet de la rendre totalement invisible aux yeux de l’animal qui évolue en surface. La température de l’eau est placée à 21°C ± 1°C, ce qui confère à ce milieu un caractère aversif suffisant pour motiver l’animal à réaliser la tâche consistant à retrouver et monter sur la plateforme. Cette dernière, qui est un cylindre en plastique transparent de 11 cm de diamètre, est positionnée à environ 2 cm sous la surface de l’eau. La salle, Figure 31B, dans laquelle se déroule ce test comprend de nombreux indices

distaux stables disposés autour de la piscine (peintures fortement contrastées sur les murs, les

équipements électriques, le bureau, l’évier etc.) de manière à faciliter la mise en place d’une mémoire spatiale allocentrique permettant à l’animal de se repérer et de localiser la plateforme. Une caméra est placée au-dessus de la piscine de Morris et est reliée à un ordinateur qui permet de mesurer et d’enregistrer plusieurs paramètres à l’aide du logiciel Smart (SD instruments, États-Unis).

3.3. Protocole

Le protocole utilisé a été identique pour toutes les expériences. Ce test comporte trois phases principales qui sont l’habituation (ou familiarisation), l’acquisition (ou apprentissage) et enfin un test de rappel (ou rétention) qui sont toutes trois effectuées dans la même pièce avec le même dispositif (e.g. Lopez et al., 2012 ; Loureiro et al., 2012 ; Cholvin et al., 2013).

L’habituation s’effectue sur une seule journée avec quatre essais consécutifs par rat. Le rat est placé dans l’enceinte en présence d’une plateforme visible située à 1 cm environ au-dessus de la surface de l’eau et placée au centre du quadrant Sud-Est (SE). Cette journée d’habituation permet à l’animal de se familiariser avec le dispositif et la tâche à effectuer consistant à trouver l’unique échappatoire et à y grimper. Cette étape permet aussi de vérifier l’absence de déficit visuo-spatial ou locomoteur pouvant biaiser les résultats. Au cours de cette phase, la piscine est entourée d’un épais rideau empêchant l’accès aux indices distaux externes.

Lors de l’acquisition, les rats sont entraînés pendant 8 jours à raison de 4 essais consécutifs par jour. Ils sont placés dans l’enceinte en présence d’une plateforme cachée (2 Figure 31 : Dispositif de la

piscine de Morris (A)

Représentation schématique du dispositif. (B) Photographie de la pièce dédiée à la piscine de Morris au laboratoire. Adaptée

cm au-dessous de la surface de l’eau) située au centre du quadrant Nord-Ouest (NO). Les

points de lâcher varient au cours des essais et des jours, Figure 32, et les animaux sont

toujours lâchés face à la paroi du dispositif. L’essai est interrompu lorsque l’animal a rejoint la plateforme ou lorsqu’un délai de 60 secondes est écoulé. Dans ce cas, l’expérimentateur guide l’animal jusqu’à la plateforme, de manière à ce qu’il l’atteigne en nageant. Une fois sur la plateforme, le rat y est laissé 10 secondes avant d’être récupéré et de débuter l’essai suivant. La distance parcourue, la latence pour rejoindre la plateforme, la vitesse de déplacement ainsi que le temps passé à proximité des parois du dispositif (thigmotaxie, un indice d’anxiété chez les rongeurs) étaient enregistrés lors de cette phase d’acquisition afin d’évaluer les performances des animaux.

Enfin le test de rétention permet d’évaluer la mémoire de l’emplacement de la plateforme. Dans notre étude, nous mesurons le rappel à 5 jours pour la mémoire récente et à

25 jours pour la mémoire ancienne sur deux groupes de rats distincts (Lopez et al., 2012 ; Loureiro et al., 2012). Ce test s’effectue par un passage unique dans le dispositif où la

plateforme est retirée, le reste du dispositif et de la pièce étant en tout point identique à la

phase d’acquisition. L’essai dure 60 secondes et le rat est introduit dans le dispositif à un

point de lâcher spécifique qui diffère de ceux utilisés auparavant, toujours face à la paroi. Le

temps passé dans chaque quadrant virtuel est alors enregistré. Ainsi, l’animal passant

significativement plus de temps que le hasard (i.e. 15 secondes) dans le quadrant cible est

un animal qui se souvient de l’emplacement de la plateforme, on parle alors de préférence de place (D’Hooge et De Deyn, 2001). A contrario, un animal se déplaçant de manière totalement aléatoire dans le dispositif et passant environ 15 secondes dans chacun des quadrants (sans exprimer de préférence de place) traduira un animal incapable de rappeler

Figure 32 : Représentation schématique des différents points de lâcher au cours du protocole en piscine de Morris.

l’emplacement de la plateforme. Le second paramètre enregistré est le nombre de croisements de la zone cible, à savoir un disque virtuel d’un diamètre de 31 cm (10 cm autour d’une plateforme de 11 cm, soit 750 cm² et 3,75% de la surface totale de la piscine de Morris) centré sur la plateforme et appelé annulus. Le nombre de passage de l’animal dans cette zone au cours du test de rétention est utilisé comme indice de la précision de la mémoire (Lopez et al., 2012).