Evaluation de l’intégrité de l’ADN génomique

La taille du génome des bactéries est de l’ordre de la mégabase (Mb). Par conséquent, une électrophorèse classique ne permettrait pas de faire migrer un ADN aussi grand. L’électrophorèse en champ pulsé (PFGE) est donc utilisée.

2.13.1. Principe général de l’électrophorèse en champ pulsé

L’électrophorèse en champ pulsé a été découverte en 1984 par David C. Schwartz et Charles R. Cantor [149]. Le principe est le même que pour une électrophorèse classique : les fragments d’ADN sont séparés en fonction de leur taille grâce à un gel d’agarose. Les fragments de petites tailles migrent plus vite que ceux de grandes tailles. Cependant, l’invention vient de l’application d’un champ électrique pulsé. De plus, plusieurs paires d’électrodes disposées autour du gel permettent d’appliquer le champ avec un angle pouvant aller de 90° à 120°. L’ADN étant très long, il faut qu’il trouve un passage entre les mailles du gel. Le changement de direction du champ électrique permet à l’ADN de se réorienter dans le sens du nouveau champ. La mobilité étant plus longue pour les fragments de grande taille, c’est de cette manière qu’ils seront séparés. Les fragments de plus grande taille se retrouveront en haut du gel alors que ceux de plus petite taille se situeront en bas du gel. Un dernier paramètre influençant la migration des fragments d’ADN et la résolution du gel est la durée de l’impulsion, modulable de 0,1 à 65 000 s [150,151]. La Figure 46 représente le principe général de la PFGE (gel d’électrophorèse en champ pulsé).

Figure 46 : Principe général de la PFGE. Les flèches en bleu montrent le parcours de l’ADN lors de l’application d’un courant entre les paires d’électrodes A-A’ et C-C’.

Fragments d’ADN de différentes tailles

A A’ B C B’ C’

2.13.2. Réalisation des essais

Avant de commencer les essais sur les bactéries, l’activité des endonucléases est testée directement sur l’ADN extrait des spores et n’ayant subi aucun traitement ni par les faisceaux d’électrons ni par les décharges électriques. Pour l’extraction de l’ADN, le protocole ci-dessous est suivi jusqu’à l’étape de rinçage après la digestion par la protéinase K. Les plugs sont alors placés sous une lumière UV (λ=254 nm, Spectroline EF-180/FE, Spectronics Corporation, USA) pendant 50 s ou dans 1 mL d’une solution de H2O2 (Sigma-Aldrich, France) à 5% pendant

30 min à température ambiante. Ensuite, les étapes de digestion avec les différentes endonucléases sont effectuées.

- Pour les faisceaux d’électrons, 100 µL d’une suspension de Bacillus pumilus à DO600 nm

de 20 sont déposés sur gélose PCA. Ensuite, 2 ou 10 impulsions à 100 Hz et 2 cm sont appliquées. Pour les spores, plusieurs boites de Pétri stériles et vides contenant 10 spots de 10 µL de solution de Bacillus pumilus sporulé sont traitées avec 10 impulsions à 100 Hz et 2 cm.

- Pour les décharges électriques, dans le cas des bactéries végétatives, le tapis bactérien ayant poussé pendant 16 h à 37°C sur gélose PCA est récupéré par ajout de 4 x 1 mL d’eau PPi stérile par boite. Deux boites de Pétri sont utilisées par essai. La suspension obtenue est ensuite déposée dans 8 L d’eau distillée stérile. Pour les spores bactériennes, 40 mL de suspension sont déposés dans 8 L d’eau distillée stérile. Dans les deux cas, 500 impulsions sont appliquées avec une fréquence de répétition de 10 Hz.

- Pour évaluer l’influence des UV produits par les décharges électriques après 500 impulsions à 10 Hz sur l’ADN des spores de Bacillus pumilus, 3,6 mL d’une suspension à DO600 nm de 0,5 sont placés dans une cuvette en Quartz au-dessus des

électrodes. Cette opération est répétée 8 fois afin d’avoir suffisamment de matériel pour extraire l’ADN.

Après récupération des échantillons, la suspension est concentrée afin d’obtenir une DO600 nm

égale à 10.

1 mL des solutions est récupéré dans des Eppendorf 1,5 mL et centrifugé 5 min à 12 000 g. Pour la lyse du manteau, le culot est repris dans 500 µL de solution de dénaturation TUDSE préparée extemporanément et incubé 45 min à 37°C. L’opération est répétée deux fois. La solution est de nouveau centrifugée pendant 5 min à 12 000 g. Ensuite, les culots sont lavés 5 fois avec du tampon TES, puis resuspendus dans ce même tampon et placés à 4°C.

Le lendemain, les tubes sont vortexés puis, une mesure de DO600 nm est effectuée afin d’ajuster

cette dernière à 3 pour les spores et à 0,5 pour les cellules végétatives dans 1 mL de TES. Les tubes sont centrifugés à 12 000 g pendant 5 min et resuspendus dans 200 µL de tampon de lyse 2X préparé extemporanément. Immédiatement, un volume identique de CleanCut Agarose à 2% est ajouté. Les tubes sont vortexés et 90 µL sont déposés dans les moules à plug. Après solidification, les plugs sont déposés dans 1 mL de tampon de lyse 1X et mis à incuber à 37°C pendant 2 h sous légère agitation.

Les plugs sont ensuite rincés avec 1 mL d’eau milli-Q DNases free et mis à incuber sur la nuit à 50°C dans 1 400 µL de tampon de déprotéinisation.

Les plugs sont rincés avec du tampon TE à température ambiante sous légère agitation, puis avec du tampon TE contenant 1 mM de Pefabloc SC (Roche) (inhibiteur de protéases) à 37°C, et deux lavages avec du tampon TE à température ambiante. Le temps d’incubation entre chaque lavage est de 1 h.

Les plugs sont ensuite découpés en bande de 2 mm x 5 mm.

Le marqueur de taille choisi est Lambda (48,5-1 000 kb ; Bio-Rad) [152,153].

Pour les plugs digérés par l’Endonucléase IV, chaque plug est équilibré dans 150 µL de tampon NEB 3 1X pendant 30 min à 37°C sous légère agitation. Puis, 150 µL de tampon NEB 3 1X frais contenant l’Endonucléase IV à 5 U sont déposés et mis à 37°C pendant 1 h sous légère agitation. Pour les plugs digérés avec la T4 Endonucléase V, le tampon utilisé est le tampon T4 PDG.

Les plugs non digérés par l’endonucléase sont conservés au frigo jusqu’à leur utilisation. Après les digestions, les plugs sont équilibrés dans 150 µL de tampon O 1X (Tampon O 10X fournit avec l’enzyme) sous légère agitation pendant 30 min à 37°C. Le tampon est éliminé et 150 µL de tampon O 1X frais est ajouté avec 15 U de NotI. L’ensemble est mis à 37°C sur la nuit sous légère agitation.

Les plugs sont lavés deux fois dans du tampon TE à température ambiante pendant 1 h. Dans les cas de digestion par la Nucléase S1, après la digestion par NotI, les plugs sont lavés avec 1 mL d’eau DNase free et équilibrés avec 300 µL de tampon Nucléase S1 1X pendant 30 min à 37°C sous légère agitation. Le tampon est éliminé. L’ADN est digéré avec 3 U de Nucléasse S1 (ThermoScientific) dans 300 µL de tampon Nucléase S1 1X frais pendant 1 h à 37°C sous légère agitation. Les plugs sont ensuite lavés 4 fois avec 1 mL de tampon TE pendant 30 min à température ambiante sous légère agitation.

Les fragments sont ensuite déposés dans les différents puits du gel d’agarose à 1% certifié pour les champs pulsés (Bio-Rad). Les plugs sont fixés par l’ajout dans les puits d’agar en surfusion (Bio-Rad) jusqu’au remplissage du puits. Le gel est ensuite déposé sur la PFGE au contact de 2 L de tampon TAE à 1X. L’électrophorèse CHEF-DR III Chiller System de chez Bio- Rad est utilisée (Figure 47). Les conditions de migration sont 14°C pendant 18 h à 6 V/cm avec une augmentation de la durée des impulsions de 1 à 50 s et un angle de 120°.

Après les 18 h de migration, le gel est transféré dans un bain de 200 mL de BET à 0,5 µg/mL pendant 30 min sous légère agitation à température ambiante. Le gel est ensuite rincé dans 300 mL d’eau milli-ro et laissé sous légère agitation à température ambiante pendant 40 min. La fluorescence est révélée grâce au transilluminateur Gel Doc XR (Bio-Rad). Les images sont acquises avec le logiciel Quantity One v.4.6.2 de chez Bio-Rad [152,153] (Figure 48).

Figure 47 : Electrophorèse CHEF-DR III Chiller System avec à gauche le système de refroidissement, au centre la cuve d’électrophorèse et à droite l’alimentation.

Figure 48 : Résumé des différentes étapes de récupération, digestion et migration de l'ADN.

Intact Dégradé CHEF-DR III Chiller System

(Bio-Rad) Décoating

Solution détergente (TUDSE)

Spores piégés dans des plugs d’agarose Lyse du cortex et de la membrane sporale 2 mg/mL de lysozyme ADN super enroulé piégé dans l’agarose Dégradation de l’ARN 0,2 mg/mL de Rnase A Déprotéinisation 1 mg/mL de protéinase K

Digestion par NotI PFGE

Révélation des fragments

0,5 µg/mL de BET

Bactéries piégées dans des plugs

d’agarose Lyse de la membrane 2 mg/mL de lysozyme ADN super enroulé piégé dans l’agarose Dégradation de l’ARN 0,2 mg/mL de Rnase A Digestion par Endo IV ou Endo V Digestion par Nucléase S1

2.13.3. Composition des tampons

Tableau 8 : Solution de dénaturation TUDSE

Composé Concentration finale

Tris-HCl (pH 8) 50 mM

EDTA (pH 8) 10 mM

Urée 8 M

Dithiothreitol (mis au dernier moment) 50 mM Dodécylsulfate de sodium (SDS) 1%

Tableau 9 : Tampon TES

Composé Concentration finale

Tris-HCl (pH 8) 10 mM

EDTA (pH 8) 10 mM

Na-Cl 150 mM

Tableau 10 : Tampon de lyse 2X

Composé Concentration finale

Tris-HCl (pH 8) 50 mM

EDTA (pH 8) 50 mM

Tween 20 0,5%

Triton X-100 0,5%

Lysozyme (Sigma-Aldrich, France) 4 mg/mL RNase A (Euromedex, France) 0,4 mg/mL

Tableau 11 : Tampon de déprotéinisation

Composé Concentration finale

Tris-HCl (pH 8) 50 mM EDTA (pH 8) 50 mM Tween 20 0,5% Triton X-100 0,5% Guanidine HCl 3 M Tween 20 20% Protéinase K 1 mg/mL

Tableau 12 : Tampon TE

Composé Concentration

Tris-HCl (pH 8) 10 mM

EDTA (pH 8) 1 mM

Tableau 13 : Tampon NEB 3 10X

Composé Concentration Tris-HCl (pH 7,5) 500 mM MgCl2 100 mM NaCl 1 M Dithiothreitol 10 mM Tableau 14 : Tampon T4 PDG 10X Composé Concentration Na2HPO4 (pH 7,2) 250 mM EDTA 10 mM NaCl 1 M Dithiothreitol 10 mM

Tableau 15 : Tampon Nucléase S1 5 X

Composé Concentration

Acétate de sodium (pH 4,5) 200 mM

NaCl 1,5 M

ZnSO4 10 mM

Tableau 16 : Tampon TAE 50X

Composé Concentration

Tris base 45 mM

EDTA (pH 8) 1 mM

Acide borique 45 mM

Tous les tampons sont filtrés au moyen d’un filtre de porosité 0,20 µm (ClearLine®) ou autoclavés si besoin. Ils sont conservés à -20°C sous forme d’aliquots de 1 mL pour les tampons

des enzymes ; à 4°C pour les tampons TE et TES et à température ambiante pour le TAE. Les autres tampons sont préparés extemporanément.