Evaluation de l’activité antioxydante in vitro

2.4.1. Test de réduction du radical DPPH

L’activité anti-radicalaire des différents extraits est déterminée en utilisant le diphényl picryl- hydrazyl (DPPH) comme un radical libre relativement stable selon le protocole décrit par Shekhar and Anju (2014). Dans ce test, les antioxydants réduisent DPPH le ayant une couleur violette en un composé jaune. La solution du DPPH est préparée par solubilisation de 4 mg de DPPH dans 100 ml de méthanol. Ensuite, dans des microplaques de 96 puits, 40 μl des solutions d’extrait ou standards (butylated hydroxytoluene: BHT) sont ajoutés à 160 μl de DPPH, le mélange est laissé à l’obscurité pendant 30 min et la décoloration par rapport au contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesurée à 517 nm. L’activité anti-radicalaire est estimée selon l’équation ci-dessous:

45

2.4.2. Test deréduction du radical ABTS

L’analyse spectrophotométrique de l’ABTS.+ _{a été déterminée selon la méthode de Re et al.}

(1999). Le radical ABTS.+ _{a été produit par la réaction entre d’ABTS 7 mM dans H}

2O et de

persulfate de potassium 2.45 mM, le mélange a été stocké à l’obscurité à température ambiante pendant 12 h.

L’oxydation d’ABTS a commencé immédiatement mais l’absorbance n’était pas stable avant 6 h de temps. Avant l’utilisation du radical ABTS.+_{, la solution a été diluée par l’éthanol jusqu’à}

l’obtention d’une absorbance de 0.708 ± 0.025 à 734 nm. Ensuite, 160 µl de la solution d’ABTS.+

à été ajoutés à 40 µl de la solution de l’extrait dans l’éthanol à différentes concentrations. Après 10 min, l’absorbance a été mesurée à 734 nm, en utilisant un lecteur de microplaques de 96 puits. La capacité de piégeage de l’ABTS.+ _{a été calculée selon la réaction suivante :}

% d’activité anti-radicalaire = (Abscontrôle–Abséchantillon) x 100/ Abscontrôle

2.4.3. Test du superoxyde DMSO alcalin

Le pouvoir réducteur de l’extrait des plantes à capturer l’anion superoxyde (O2•-_{), empêchera}

la réduction du nitro blue tetrazolium (NBT2+_{) en formazan rouge. La génération de ce radical}

anionique stable dans un système non enzymatique est favorisée par l’alcalinisation du DMSO. Les absorbances obtenues permettent de calculer un pourcentage de réduction du NBT2+

(Kunchandy and Rao, 1990). Brièvement, dans une microplaque de 96 puits, le mélange réactionnel contient 40 µl d’extrait de plante ou du standard, 130 µl du DMSO alcalin (20 mg de NaOH dans 100 ml de DMSO) et 30 µl du NBT (1mg/ml). L’absorbance est mesurée à 560 nm après 5 minutes d’incubation. L’activité des échantillons vis-à-vis de l’anion superoxyde est exprimée en pourcentage de chélation selon l’équation de Rahman et al. (2013) :

% d’activité de chélation = (Abséchantillon – Abscontrôle) x 100/ Abséchantillon

2.4.4. Test du blanchissement de la β-carotène

La capacité antioxydante est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydative du β-carotène qui se traduit par sa décoloration par les produits d’oxydation de l’acide linoléique. Les radicaux peroxydes générés par l’oxydation de l’acide linoléique, vont par la suite oxyder le

β-carotène entrainant ainsi la disparition de sa couleur rouge. Cependant, la présence d’un

antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres dérivés de l’acide linoléique et donc prévenir l’oxydation et le blanchissement de β-carotène (Kartal et al., 2007).

Une émulsion β-carotène/acide linoléique préparée par la solubilisation de 2 mg de β-carotène dans 1 ml de chloroforme, a été ajoutée à 25 µl d’acide linoléique et 200 mg de tween 40. Après évaporation complète du chloroforme au rotavapeur BUCHI, 100 ml d’eau saturée en oxygène sont ajoutés. L’émulsion résultante est vigoureusement agitée. Dans des tubes à essai

46

contenants 2.5 ml du mélange précédant, 350 µl d’extrait sont additionnés puis incubés à l’obscurité à la température du laboratoire. Deux tubes contrôles ont été aussi préparés avec la même procédure: l’un contenant un antioxydant de référence BHT (témoin positif) et l’autre sans antioxydant (témoin négatif) où l’échantillon est remplacé par 350 µl de méthanol ou de l’eau distillée. La cinétique de décoloration de l’émulsion en présence et en absence de l’antioxydant est suivie à 470 nm à des intervalles de temps réguliers pendant 48 heures. L’activité antioxydante des extraits (AA %) est calculée selon l’équation suivante:

AA % =AA = [1−(AbsS0−AbsSt)∕(AbsC0−AbsCt)] ∗ 100.

2.4.5. Test de chélation du fer (ferrozine)

La capacité chélatrice de métaux par les extraits a été mesurée en suivant l'inhibition de la formation du complexe Fe2+_{-Ferrozine après incubation des échantillons, à différentes}

concentrations, avec le fer divalent selon la méthode de Decker and Welch (1990). Initialement 40 µl des solutions d’échantillons ont été mélangées avec 40 μl de FeCl2 (0.2 mM dans l’eau

distillée) et 40 μl de méthanol. Après 5 min, la réaction est initiée par l’addition de 80 μl de Ferrozine (0.5 mM) au milieu réactionnel, le mélange a été bien agité puis laissé réagir pendant 10 min. permettant ainsi la formation de complexe avec une couleur violet (Fe2+_{-Ferrozine) ayant un} maximum d’absorption à 562 nm. Par ailleurs, le contrôle négatif contient tous les réactifs à l’exception des extraits. L’éthylène diamine tétra acétique (EDTA) a été utilisé comme chélateur de référence. L’activité des échantillons vis-à-vis du fer est exprimée en pourcentage de chélation selon l’équation :

% d’activité de chélation = (Abscontrôle–Abséchantillon) x 100/ Abscontrôle

2.4.6. Test du pouvoir réducteur du FeCl3

L’activité du pouvoir réducteur des extraits de plante est déterminée par la méthode d’Oyaizu (1986) avec une légère modification. Dans une microplaque de 96 puits, 10 μl d’extrait ou de standard est ajouté à 40 μl du tampon phosphate (0.2 M, pH 6.6) et 50 μl potassium ferricyanide (1%). Le mélange est incubé à 50°C pendant 20 minutes. 50 μl d’acide tri-chloro acétique (TCA) (10%) sont ajouté pour stopper la réaction. Après, 40 μl d’eau distillée et 10 μl du FeCl3 (0.1%)

sont ajoutés au milieu réactionnel. L’absorbance est mesurée directement à 700 nm. Le pouvoir réducteur augmente avec l’augmentation de l’absorbance.

2.4.7. Test du pouvoir réducteur (méthode du phénanthroline)

L’estimation du pouvoir réducteur des extraits en utilisant la méthode de phénanthroline est déterminé selon la technique de Szydłowska-Czerniak et al. (2008). Brièvement, dans une microplaque de 96 puits, le milieu réactionnel est composé de 10 µl d’extrait, 50 µl du FeCl3

47

l’obscurité pendant 20 min à 30°C puis les absorbances sont mesurées à 510 nm. Le BHT est utilisé comme standard

2.4.8. Test de la réduction cuprique (CUPRAC)

L’activité antioxydante par réduction cuprique des extraits a été déterminée par la méthode CUPRAC (Apak et al., 2004). Pour chaque unité d’une plaque de 96 unités des solutions ont été ajoutées: 50 µl de Cu(II) (10 mM), 50 µl de neocuproine (7.5 mM), 60 µl de tampon NH4Ac (1

M, pH = 7), et 40 µl de l’extrait à différentes concentrations. Après une heure du temps et à l’aide d’un lecteur de microplaques, l’absorbance a été enregistrée contre un blanc à 450 nm. Le pouvoir antiradicalaire A50 est définie comme la concentration de l’extrait à donner une absorbance égale

à 0.5.