Solutions
- Composition du milieu intra-pipette (contenant 100 nM de Ca2+ libre) : KCl : 120 mmol/L ; EGTA : 8 mmol/L ; HEPES : 10 mmol/L ; MgCl2 : 6,8 mmol/L ; CaCl2 : 3 mmol/L ; ATPNa2 : 4 mmol/L ; GTPNa2 : 0,4 mmol/L ; pH = 7,2
- Composition du milieu extracellulaire : NaCl : 130 mmol/L ; KCl : 4 mmol/L ; MgCl2 : 1,8 mmol/L ; CaCl2 : 1,8 mmol/L ; HEPES : 10 mmol/L ; glucose : 11 mmol/L ; pH = 7,4
4. Etudes biochimiques : Quantification de l’expression protéique :
Western Blot
La technique du western blot permet de quantifier et de comparer le profil d’expression des protéines. Les modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation, la nitrosylation, l’oxydation ou l’ubiquitinylation peuvent être également détectées.
La technique de western blot comprend plusieurs étapes :
1. L’extraction protéique : La première étape du western blot consiste à extraire les protéines contenues dans l’échantillon, dans notre cas, le VG des rats, prélevé au sacrifice et conservé à -80°C. Afin d’obtenir une concentration suffisante de protéines, 50 mg de tissus sont pesés au départ en évitant la décongélation des échantillons. Pour extraire les protéines, l’échantillon est placé dans un tampon de lyse contenant : 10 mM de Tris maléate pH= 6, 35 mM de NaF, 1 mM de Na3VO4, 1% de Triton et un cocktail d’inhibiteurs de protéases (1X SigmaFAST). Pour induire la lyse, un polytron® manuel refroidi dans de la glace préalablement est utilisé afin de broyer mécaniquement les tissus. Le volume de tampon pour 1 mg de tissu est de 20 μL. Le tissu est mixé au polytron à vitesse maximale pendant 5 à 10 secondes. Toutes les étapes citées sont effectuées à froid afin de limiter la dégradation des protéines induite par la lyse cellulaire. Les échantillons sont ensuite centrifugés et les surnageants contenant les protéines sont récupérés. Les lysats sont ensuite
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dosés en duplicata par l’intermédiaire d’un kit commercial RC-DC (Reducing agent Compatible-Détergent Compatible) (Bio-Rad, Marnes-la-coquette, France) et mesurés par spectrophotométrie à l’aide d’une courbe étalon avec des concentrations croissantes de BSA.
2. La migration : Avant de déposer les échantillons dans le gel, les protéines subissent une étape initiale de dénaturation à l’aide d’un tampon « Laemmli ». Ce tampon contient principalement une coloration au bleu de Bromophénol, du glycérol qui augmente la densité de l’échantillon (crucial pour le dépôt), du β-mercaptoéthanol qui rompt les ponts disulfures et du SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) détergent qui charge négativement les protéines pour permettre la séparation de ces dernières par électrophorèse donc en fonction de leur poids moléculaire. Un chauffageà 95°C pendant 5 minutes assure la dénaturation des protéines. Les échantillons sont déposés dans les puits d’un gel de polyacrylamide en gradient 4% / 20%. Les protéines sont séparées par électrophorèse dans un tampon tris-glycine-SDS (SDS-PAGE : « Sodium Dodecyl Sulfate–
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis ») pendant 30 minutes à 70 Volts et puis pendant une heure
à 150 Volts. Un marqueur de poids moléculaire (Thermo Scientific, Illkirch, France) sert de repère visuel lors de la migration.
3. Le transfert : Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose (GE
Healthcare, USA) selon la méthode de transfert liquide à froid dans un tampon tris-glycine. Le
tampon contient de l’éthanol ce qui favorise l’ancrage des protéines sur la membrane. Cette étape est réalisée à 100 Volts pendant 60 minutes.
3. La saturation et la révélation : Une fois le transfert effectué, les membranes de nitrocellulose sont alors saturées dans du « Starting Block buffer » (TBS) pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation. La saturation permet le recouvrement des séquences aspécifiques limitant ainsi les détections croisées et un « bruit de fond » trop élevé lors de la révélation finale. Ensuite, les membranes sont incubées avec les anticorps primaires afin de détecter les protéines d’intérêt. La reconnaissance des protéines se fait grâce aux fractions variables de l’anticorps, spécifiques d’un épitope (anticorps monoclonaux, souvent plus spécifiques) ou de plusieurs épitopes (anticorps polyclonaux) présents dans la séquence protéique. Les anticorps primaires sont dilués dans le « Starting Block blocking buffer » pur et à la dilution recommandée par le fournisseur. Les
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membranes sont incubées 24h en présence des anticorps primaires à 4°C sous agitation. Ensuite, des lavages successifs, sont effectués, avec du PBS /Tween à température ambiante. La révélation est réalisée par l’utilisation d’anticorps secondaires fluorescents dans les infrarouges (IRdye800® ou IRdye700®) spécifiques de la fraction constante de l’anticorps primaire à l’aide du système Odyssey® (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska, USA) par lecture de la fluorescence émise par la membrane.
Pour la détection des protéines nitrosylés, les échantillons ont été incubés au préalable avec les anticorps primaires et le tampon RIPA (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Triton- X100 5mM NaF, 1mM Na3VO4, et inhibiteurs des protéases) pendant une heure à 4°C. Ensuite les complexes immuns ont été incubés avec des billes de protéine G Sepharose (Sigma-Aldrich) à 4°C pendant une heure. Les protéines ont été séparées sur SDS / PAGE comme décrit ci-dessus.
Les signaux présents sur la même membrane ont été analysés à l’aide du logiciel Odyssey V3.0 et les intensités obtenues pour chaque échantillon sont comparées à l’intensité d’une protéine de ménage (Tubuline) de ces mêmes échantillons. Les résultats représentent la moyenne de trois western blot répétés pour chaque échantillon.
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Liste des anticorps utilisés :
Anti-FKBP12.6 : Anticorps primaireReD SYSTEM, dilution 1:500 Anti-NCX : Anticorps primaire SWANT, dilution 1:1000
Anti-PLN : Anticorps primaireABCAM, dilution 1 :1000
Anti-PLN phospho-Thr17 : Anticorps primaire (forme phosphorylée) BADRILLA, dilution 1:1000 Anti-RyR: Anticorps primaire ABCAM, dilution 1:500
Anti-RyR2 phospho-Ser2814 : Anticorps primaire (forme phosphorylée) BADRILLA, dilution 1:500
Anti-SNO RyR : Anticorps primaire (nitrosylé) ABCAM, dilution 1:1000 Anti-SERCA2A : Anticorps primaire BADRILLA, dilution 1:1000
Anti-Tubulin : Anticorps secondaire Santa Cruz Biotechnology, dilution 1 :1000