Etude de la sensibilité de L. pneumophila aux antibiotiques

5.1.1 Les tests extracellulaires

Les Legionella sont des bactéries de croissance fastidieuse ce qui complique l’évaluation de

leur sensibilité aux antibiotiques in vitro. Les valeurs de CMI dépendent du milieu de culture

utilisé. Le milieu BCYE présente des inconvénients liés au charbon qui inactive certaines

molécules d’antibiotiques comme les tétracyclines (Ruckdeschel et Dalhoff 1999).

L’utilisation d’un milieu gélosé dépourvu de charbon tel que le BKYE (Buffer Ketoglutarate Yeast Extract) ou le BSYE (Buffered Starch Yeast Extract) donne des résultats plus fiables (Schulin et al 1998). Les CMIs peuvent également être déterminées en milieu liquide BYEα

des CMIs très inférieures à celles obtenues en milieu BCYE. La méthode du E-test et les méthodes de dilution des antibiotiques en milieu gélosé ou liquide sont à privilégier.

L’inoculum bactérien varie entre différentes études de 10³ à 10⁷ UFC/ml, mais son

augmentation d’un facteur 102multiplie les CMIs d’un facteur 2 à 4 (Ruckdeschel et Dalhoff

1999, Pohlod, et al. 1981, Rhomberg et Jones 1994). L’incubation se fait à 35°C, en

atmosphère enrichie ou non avec 5% de CO2, pendant 48 à 96 heures (Pendland, et al. 1997, Liebers, et al. 1989, Pohlod, et al. 1981). La technique optimale de détermination des CMIs pour les Legionella demeure toutefois à définir.

Une évaluation systématique des CMIs des souches isolées de Legionella n’est pas

recommandée actuellement, du fait que les CMIs sont peu prédictives de l’activité des

antibiotiques sur les formes intracellulaires des Legionella. D’autre part, aucune résistance

acquise aux antibiotiques utilisés pour le traitement de la légionellose n’a été décrite en

situation clinique à ce jour, malgré la fréquence des échecs thérapeutiques.

In vitro, en milieu extracellulaire, à l’exception de la vancomycine, des lincosamides, des

sulfamides et de la colistine, la plupart des antibiotiques sont actifs vis-à-vis des Legionella.

Des β- lactamases hydrolysant les pénicillines G et A, et la plupart des céphalosporines sont largement produites au sein des espèces du genre Legionella(à l’exception de L. micdadei, L.

feelii, L. maceachernii). On observe alors une efficacité de l’utilisation des inhibiteurs de β

-lactamases tel que l’acide clavulanique. L’imipenème est très actif in vitro.

La rifampicine possède les CMIs les plus basses et un ratio CMB/CMI entre 1 et 16 (Roch et Maurin 2005, Barker et Farell 1990), De nombreuses études ont montré que les macrolides sont efficaces in vitro vis-à-vis des Legionella (Dubois, St-Pierre et C 1999, Felmingham, et

al. 1991) ; le ratio CMB/CMI pour les macrolides est entre 2 et 8 (Roch et Maurin 2005, Barker et Farell 1990). Les fluoroquinolones ont une excellente activité vis-à-vis des Legionella (Roch et Maurin 2005, Barker et Farell 1990).

Très récemment, une activité supérieure à celle de l’azithromycine a été démontrée pour la solithromycine in vitro (Mallegol et al. 2013).

5.1.2 Les tests intracellulaires :

Les méthodes extracellulaires conventionnelles de détermination des CMIs ne permettent pas de prédire la sensibilité aux antibiotiques des Legionella en situation intracellulaire. Ainsi,

certaines bêtalactamines présentent des CMI basses in vitro mais sont inactives in vivo du fait

de leur incapacité à pénétrer dans les cellules eucaryotes. L’utilité des modèles cellulaires est

donc de prédire l’efficacité des antibiotiques vis-à-vis des Legionella au cours de leur

multiplication intracellulaire. Ils permettent de définir une CMIE pour chaque antibiotique,

c’est-à-dire une concentration minimale extracellulaire d’un antibiotique capable d’inhiber la croissance intracellulaire d’une souche de Legionella. Différents types cellulaires ont été

utilisés : des macrophages alvéolaires prélevés chez différents animaux de laboratoire (Edelstein et Weiss 2003, Fitzgeorge, Featherstone et Baskerville 1988, Blatch, et al. 2005), des monocytes isolés du sang humain (Havlichek, Pohlod et Saravolatz 1987, Blatch, et al. 2005), des lignées cellulaires animales (lignéeJ774.1) (Higa, et al. 1998) ou humaines (lignée U-937, HL660, TPH61, MONO Mac 6, A-549 et MRC-5) (Jung 2002, Takemura, et al. 2000, Stout, Arnold et Yu 1998, Jonas, Engels, et al. 2001, Kunishima et al 2000, Ramirez, Summersgill, et al. 1993, Roch et Maurin 2005). Dans ces modèles, les fluoroquinolones et la rifampicine sont plus efficaces que l’érythromycine pour inhiber la croissance intracellulaire

de L. pneumophila (Blatch, et al. 2005, Stout, Arnold et Yu 1998, Stout, Sens, et al. 2005). La

lévofloxacine et la moxifloxacine possèdent des ratios CMIE/CMI inférieurs à 1, ce qui correspond à une activité sur L. pneumophila intracellulaire pour des concentrations

inferieures aux CMIs (Jonas, Engels, et al. 2001). Parmi les macrolides, l’azithromycine est plus active que l’érythromycine sur les Legionella intracellulaires (Stout, Arnold et Yu 1998,

Segreti, Meyer et Kapell 1996). L’activité de la clarithromycine est également supérieure à celle de l’érythromycine dans les modèles cellulaires (Jung 2002, Blatch, et al. 2005). Plus

récemment, une nouvelle classe de macrolides, les kétolides (par exemple la télithromycine), ont montré une excellente activité vis-à-vis des Legionella dans la lignée cellulaire HL-60

(Stout, Arnold et Yu 1998) et en monocytes humains (Baltch et al 2000).

Julia Mallegol et al. (Mallegol et al. 2013).ont montré que la solithromycine possède une

activité supérieure à l’azithromycine in vitro en milieu cellulaire et en modèle cellulaire, vis-à-vis de toutes les souches de L. pneumophila sg1. Le développement clinique de ce nouveau fluoroketolide est déjà en phase 3. Cette molécule constitue une alternative prometteuse pour

le traitement de la légionellose.

En 2013, Harrison et al. (Harrison et al. 2013) ont presenté une nouvelle méhode d’évaluation

de la sensibilité de L. pneumophila basée sur la culture de cette bactérie dans l’amibe A. castellanii. Ce test a permis de montrer une propriété antibactérienne inattendu de l'inhibiteur de l’APT1 palmostatine M. L'activité antibactérienne de la palmostatine M semble être

spécifique aux bactéries des genres Legionella et Mycobacterium.

5.1.3 Modèle animal

L’efficacité in vivo des antibiotiques a été étudiée expérimentalement chez le cobaye infecté

par inhalation d'aérosols ou par inoculation directe de Legionella par voie intra-trachéale

(Edelstein, Calarco et Yasui 1984, Edelstein, Shinzato, et al. 2001). Ces tests ont montré que les bêta-lactamines et les aminosides sont inactifs in vivo sur L.pneumophila (Edelstein,

Calarco et Yasui 1984). L’azithromycine est le plus efficace parmis les macrolides (Edelstein,

Review of azithromycin activity against Legionella spp 1995). La rifampicine est moins efficace que les fluoroquinolones (Edelstein, Calarco et Yasui 1984, Nowicki, et al. 1988, Jarraud et Freney 2012). Plusieurs études ont montré que les fluoroquinolones sont plus efficaces que les macrolides (Saito, et al. 1985, Nowicki, et al. 1988). La lévofloxacine réduit

la concentration bactérienne pulmonaire dés le premiér jour d’antibiotherapie (Kashimoto, et