Etude RMN des protéines

L'étude d'une protéine par Résonance Magnétique Nucléaire est différente de l'étude d'un acide nucléique. La première structure 3D de protéine par RMN a été publiée en 1985 (Williamson, Havel et al. 1985). Depuis d'énormes progrès technologiques et méthodologiques ont été réalisés pour rendre la spectroscopie RMN performante dans la détermination de structures tridimensionnelles de macromolécules (protéines, acides nucléiques, sucres, complexes protéine/protéine ou protéine/acide nucléique). Ces progrès ont permis d'augmenter la résolution et la sensibilité de la RMN, points faibles de la technique. Ils ont consisté dans le développement de spectromètres à haut champ (22,3T actuellement) et de sondes cryogéniques. Ces progrès technologiques ont été accompagnés de développements méthodologiques : avec l'apparition du marquage isotopique (¹⁵N, ¹³C et ²H), le

N

développement de séquences RMN 3D, et 4D (Cavanagh, Fairbrother et al. 1996);(Sattler, Schleucher et al. 1999), l’utilisation de séquences TROSY (Transverse Relaxation Optimized SpectroscopY) (Pervushin, Riek et al. 1997) et l'utilisation des constantes de couplages dipolaires résiduels (Tjandra, Omichinski et al. 1997). Ces développements ont permis de réaliser l'étude structurale de biomolécules de taille de plus en plus importante. L'enzyme malate synthase de E. coli de 723 résidus (Tugarinov, Hwang et al. 2004) est actuellement la plus grosse protéine dont les déplacements chimiques sont connus (¹H, ¹³C et ¹⁵N).

3.2.1 Méthodes d'attribution RMN des protéines

La structure 3D de l'inhibiteur de trypsine de taureau de 53 résidus, publiée en 1985 (Williamson, Havel et al. 1985) par l'équipe de Kurt Wüthrich, prix Nobel de chimie 2002, a été la première structure 3D de protéine en solution. L'attribution des déplacements chimiques de ses protons, seuls noyaux alors observables en abondance naturelle de façon exploitable à l'époque, a été obtenue par la méthode d'attribution séquentielle (Wüthrich 1986) basée sur l'effet NOE.

3.2.2 Méthode d'attribution séquentielle

Cette méthode exploite les informations de corrélations scalaires révélées par les expériences de type COSY et TOCSY. Ces expériences qui mettent en évidence des corrélations entre protons au travers des liaisons permettent d'obtenir les signatures caractéristiques des systèmes de spins de chaque acide aminé.

Figure 26 : Diagramme de connectivités observables dans les spectres COSY et TOCSY pour les différents acides aminés.

L'étape suivante consiste à déterminer la position des acides aminés ainsi identifiés dans la séquence de la protéine. C'est ce que l'on appelle l'attribution séquentielle. Celle-ci est fondée sur des expériences NOESY qui permettent d'observer des protons distants de moins de 5Å.

Pour l'attribution séquentielle, on cherche les corrélations dipolaires entre le résidu i et le résidu i+1, et plus particulièrement les corrélations Hα(i)-HN(i+1) qui permettent de reconstituer l'enchaînement des systèmes de spins. La méthode d'attribution séquentielle est applicable aux protéines de petite taille, généralement inférieure à une centaine de résidus.

3.2.3 Utilisation de la RMN hétéronucléaire

L’étude structurale de macromolécules de taille de plus en plus importante par la RMN du proton seul connaît certaines limites. La gamme relativement réduite des déplacements chimiques des résonances du proton entraîne le recouvrement de résonances conduisant à des indéterminations. De plus, le temps de relaxation transversale T2 est diminué entraînant un élargissement des raies de résonances ( ₁

2

1 υ T2

∝π ). La RMN hétéronucléaire permet de palier ces difficultés. Tout d’abord elle apporte une (ou plusieurs) échelle de déplacements chimiques supplémentaires portant de nouvelles informations concernant l’environnement de l’hétéronoyau considéré. Par ailleurs, les constantes de couplage mettant en jeu un hétéronoyau (JCH=170Hz, JNH=90Hz) sont pour la plupart plus élevées que les constantes de couplage d’une paire ¹H-¹H. Le transfert de polarisation le long de la liaison X-H proportionnel à 1/2J se fera donc plus rapidement, évitant ainsi une perte de sensibilité due aux processus de relaxation transversale pour les grosses molécules. De plus, le marquage isotopique uniforme ou sélectif des macromolécules biologiques a permis de contourner le problème de la faible abondance naturelle des isotopes (¹⁵N=0.37%, ¹³C=1.1%). Enfin les mécanismes de relaxation des hétéronoyaux de spin ½ engagent essentiellement l’hétéronoyau et les protons auxquels il est directement lié. Dans un système de spins XH, la distance entre ces deux noyaux étant fixe, seule l’orientation du vecteur XH va varier au cours du temps. La relaxation hétéronucléaire reliée aux mouvements moléculaires de ce vecteur apporte des informations dynamiques beaucoup plus directes que la relaxation du proton.

La méthode d'attribution séquentielle présentée précédemment est facilitée par un marquage

15N (ou ¹³C ou les deux). L'attribution se réalise alors à partir de spectres multidimensionnels hétéronucléaires, comme par exemple les expériences 3D TOCSY-ou NOESY-HSQC éditées

15N ou ¹³ C. Ces expériences 3D sont la combinaison de deux expériences 2D : la première

TOCSY ou NOESY ¹H, et la deuxième HSQC (pour Heteronuclear Single Quantum Coherence) qui permettent d'étaler l'information selon la fréquence de l'hétéronoyau auquel sont liés les protons.

3.2.4 Attribution du backbone: les expériences HNCA et HN(CO)CA

Figure 27 : (a) Schéma des noyaux impliqués dans les expériences HNCA et HN(CO)CA (b) Corrélations pouvant être observées dans ces deux expériences (c) Constantes de couplages mises en jeu dans chacune des expériences

Ces deux expériences permettent, en théorie, l’attribution des résonances des ¹³Cα, ¹HN et

15N de la chaîne peptidique de la protéine. L'expérience HNCA (Kay, Ikura et al. 1990) corrèle les résonances ¹HN et ¹⁵N à la résonance ¹³Cα du résidu i et à la résonance ¹³Cα du résidu i-1. L'expérience HN(CO)CA (Bax and Ikura 1991) permet de relier les résonances

1HN et ¹⁵N d'un même résidu avec seulement la résonance ¹³Cα du résidu i-1 via le carbonyle CO, ce dernier n'étant pas édité au cours de l'expérience. La figure ci-dessous présente la séquence ghn_ca, provenant de biopack, que nous avons utilisée sur le spectromètre VARIAN.

Figure 28 : Séquence ghn_ca utilisée

Néanmoins il peut y avoir des superpositions de corrélations ne permettant pas d'identifier tous les résidus. Une solution possible pour lever ces ambiguïtés est l’utilisation d'une autre combinaison d'expériences fournissant des corrélations alternatives: le couple HN(CA)CO (Clubb, Thanabal et al. 1992) et HNCO (Kay, Ikura et al. 1990). L’expérience HNCO fournit uniquement les corrélations interrésiduelles tandis que l’expérience HN(CA)CO, en plus de ces corrélations, donne celles qui sont intrarésiduelles. Pour lever d'éventuelles ambiguïtés persistantes, on a recours au dernier couple d'expériences: CBCANH (Grzesiek and Bax 1992) et CBCA(CO)NH (Grzesiek and Bax 1992).

De toutes ces expériences, on extrait des données complémentaires qui permettent de réaliser l'attribution séquentielle plus facilement, en limitant les risques d'erreurs.

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3.2.5 Attribution des chaînes latérales

Outre les expériences 3D TOCSY-HSQC éditées ¹⁵N et ¹³C, les expériences HCCH-COSY (¹H-¹³C-¹³C-¹H COrrelation SpectroscopY) (Bax, Clore et al. 1990) et HCCH-TOCSY (¹

H-13C-¹³C-¹H TOtal Correlation SpectroscopY) (Bax, Clore et al. 1990) permettent d'identifier tous les protons et les carbones aliphatiques des chaînes latérales. Le résultat de l’expérience 3D HCCH-TOCSY contient la même information qu'une expérience 3D TOCSY-HSQC éditée ¹³C. Néanmoins ces expériences sont beaucoup plus sensibles car le transfert HCCH-TOCSY est bien plus efficace qu'un transfert par les protons. Les constantes de couplage ²J ou

3J entre les protons sont de l'ordre de quelques hertz (4-10 Hz) alors que les constantes de couplages ¹JCH ~ 170Hz et ¹JCC ~ 40Hz sont beaucoup plus élevées.

Finalement un certain nombre d’autres expériences permet de lever les ambiguïtés restantes.

Elles se dénomment HBHA(CBCACO)NH (Grzesiek and Bax 1993), HBHA(CBCA)NH (Wang, Lodi et al. 1994), HCC(CO)NH-TOCSY (Montelione, Lyons et al. 1992; Grzesiek, Anglister et al. 1993; Logan, Olejniczak et al. 1993), HN(CO)CACB (Yamazaki, Lee et al.

1994), HNCACB (Wittekind and Mueller 1993) et HCCNH-TOCSY (Lyons and Montelione 1993).

3.2.6 Obtention des distances

La procédure est la même que pour les acides nucléiques. Néanmoins, il faut noter que contrairement aux acides nucléiques pour lesquels les NOEs sont pour la plupart séquentiels, c'est-à-dire impliquant les résidus i et i±1, les NOEs dans les protéines peuvent être classés en trois catégories :

• Les NOEs à courtes distances, c'est-à-dire impliquant des résidus i et j tel que 1

i j− ≤ . On distingue ensuite les NOEs intrarésiduels des NOEs interrésiduels.

• Les NOEs à moyennes distances, c'est-à-dire impliquant des résidus i et j tel que 1≤ − ≤i j 5.

• Les NOEs à longues distances impliquant les résidus i et j tel que i j− ≥5. 3.2.7 Obtention des angles de torsion

Les angles de torsion du squelette peptidique peuvent être déterminés soit à partir des valeurs de couplage ³JHNHα déduites de l’expérience HNHA, soit en utilisant des méthodes combinant différents types d'informations comme le logiciel TALOS (Cornilescu, Delaglio et al. 1999) disponible à l’adresse internet suivante ). Ce

logiciel permet d’obtenir un intervalle de valeurs possibles pour les angles (φ,ψ) à partir des valeurs des déplacements chimiques de cinq atomes d’un résidu: Hα, Cα, Cβ, CO, N. TALOS considère chaque résidu dans l’environnement de ses 2 voisins et compare, pour chaque tripeptide, les déplacements chimiques mesurés à ceux de tripeptides dans une banque de données. Cette banque regroupe les données de 78 protéines de structures connues, représentant environ 9000 triplets d’acides aminés. Les dix tripeptides comportant à la fois une bonne similarité de séquence et les déplacements chimiques les plus proches de ceux de la protéine cible sont conservés. Les angles φ et ψ correspondants sont représentés sur une carte de Ramachandran. L’utilisateur valide le résultat : si dans au moins 9 cas sur 10, ceux-ci se situent au niveau de la même région favorable du diagramme de Ramachandran, la prévision est considérée comme satisfaisante. La méthode de TALOS, bien que particulièrement efficace, demeure empirique et il a été montré que les prédictions étaient fausses pour seulement 3% des angles. Les valeurs des angles de torsion ne sont pas déterminées de façon précise et on définit un intervalle de valeurs possibles pour l’angle dièdre : φmin< φ <φmax