sensibilité à l’insuline des entérocytes
Article #1
Monteiro-Sepulveda M, Touch S, Mendes-Sá C, André S, Poitou C, Allatif O, Cotillard A, Fohrer-Ting H, Hubert EL, Remark R, Genser L, Tordjman J, Garbin K, Osinski C, Sautès- Fridman C, Leturque A, Clément K, Brot-Laroche E. Jejunal T-cell inflammation in human obesity correlates with decreased enterocyte insulin signaling. Cell Metabolism. 2015 Jul 7;22(1):113-24. DOI: 10.1016/j.cmet.2015.05.020.
Contexte et objectifs :
Cette étude, réalisée en collaboration avec le Dr Edith Brot-Laroche (INSERM UMRS 1138, équipe « Physiopathologies intestinales : nutrition et fonction de barrière » dirigée par le Dr Armelle Leturque) fait l’objet d’une publication dans Cell Metabolism en 2015 (Monteiro- Sepulveda et al., 2015) et étudie pour la première fois les modifications de l’immunité intestinale dans une cohorte de 185 sujets obèses par rapport à 33 sujets minces en relation avec des paramètres biocliniques. Dans le cadre de cette collaboration, les objectifs spécifiques
de mon travail de thèse ont été :
1) d’analyser par cytométrie en flux et RT-PCR le phénotype et le profil cytokinique des lymphocytes T intestinaux en relation avec le statut pondéral et glycémique des sujets
2) et dans un deuxième temps d’évaluer in vitro les relations fonctionnelles entre lymphocytes T et entérocytes dans un système de co-culture avec la lignée Caco-2/TC7.
La première partie du travail montre d’une part l’augmentation de la surface absorptive de la muqueuse intestinale chez le sujet obèse (augmentation de la hauteur des villosités intestinales et de la profondeur des cryptes) et d’autre part l’augmentation de l’infiltrat de cellules immunitaires innées et adaptatives (macrophages, cellules dendritiques, cellules NK et lymphocytes T) dans la muqueuse jéjunale obèse. Parmi ces cellules, les lymphocytes T sont significativement augmentés dans la muqueuse jéjunale avec un tropisme préférentiel vers l’épithélium intestinal chez les sujets obèses par rapport aux sujets minces.
63 Il a été montré par nos collaborateurs que l’intestin est un tissu sensible à l’insuline. L’absorption intestinale des sucres dépend en effet du trafic insulino-sensible intracellulaire du transporteur de glucose 2 (GLUT2), dont la localisation est modifiée dans l’obésité et le diabète (Tobin et al., 2008). Ces résultats ont été validés dans l’obésité humaine (Ait-Omar et al., 2011). Dans le TA des sujets obèses, la sécrétion locale de cytokines pro-inflammatoires pourrait participer à la mise en place de cette résistance à l’insuline. Cependant, il existe peu de données concernant la relation entre l’immunité intestinale et la sensibilité à l’insuline dans l’intestin. Les lymphocytes T constituent la population immunitaire majoritaire dans la muqueuse intestinale. Ces cellules étant augmentées dans l’obésité et se trouvant en première ligne dans la protection de la barrière intestinale, nous nous sommes intéressés à la relation entre le phénotype des lymphocytes T intestinaux et la réponse à l’insuline intestinale. Ces questions font l’objet de la première partie de ma thèse.
Résultats principaux :
Dans un premier temps, nous avons évalué par RT-PCR quantitative l’expression génique de différentes cytokines et chimiokines dans des échantillons de LP ou de cellules épithéliales totales (cellules non immunitaires et cellules immunitaires) de sujets non obèses et obèses. Ces analyses ont révélé une augmentation de l’expression de l’IL-6, IL-17, IL-22 et CCL2 uniquement dans la LP et de l’IL-23, TNF-α, TGF-β et IFN-γ dans l’épithélium et la LP des sujets obèses par rapport aux sujets minces. Ces profils révèlent une augmentation de l’inflammation mucosale dans le jéjunum des sujets obèses.
L’IL-23 étant une cytokine clé dans la régulation de la réponse Th17, nous avons également exploré la signature cytokinique des lymphocytes T jéjunaux par cytométrie en flux après stimulation non spécifique avec du phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et de la ionomycine.
Nos résultats montrent une augmentation du pourcentage de cellules CD4+ produisant de l’IL-
17 et de l’IL-22 dans la LP des sujets obèses, et une augmentation du pourcentage de cellules
CD8+ produisant de l’IFN-γ la LP et dans l’épithélium des sujets obèses par rapport aux sujets
minces. Ces résultats suggèrent que dans l’obésité, l’immunité jéjunale est orientée vers des réponses proinflammatoires, notamment de type Th17/Th22.
Afin d’évaluer l’impact fonctionnel du profil pro-inflammatoire des lymphocytes T intestinaux sur le jéjunum, nous avons mis en place un système de co-culture in vitro/ex vivo utilisant la lignée Caco-2/TC7 et des cellules T CD3+ immunosélectionnées à partir de LP ou d’EPI de sujets minces ou obèses (Figure 20). La lignée Caco-2/TC7 a la particularité de s’organiser en
64 monocouche d’entérocytes polarisés en culture sur filtre semi-perméable et de présenter un phénotype d’intestin grêle, mimant ainsi la barrière épithéliale (Chantret et al., 1994).
Figure 20. Description du système de co-culture mettant en jeu des entérocytes Caco-2/TC7
dans le compartiment apical et des LT de patients minces ou obèses dans le compartiment basolatéral.
Après 48h de co-culture, nous avons évalué la sensibilité à l’insuline entérocytaire en quantifiant par Western Blot la phosphorylation d’Akt, une kinase impliquée dans la voie de signalisation de l’insuline, dans les entérocytes Caco-2/TC7 en réponse à une stimulation par
l’insuline. Nos résultats montrent qu’en co-culture avec des cellules CD3+ activées de sujets
obèses et non de sujets minces, la phosphorylation d’Akt est réduite dans les Caco-2/TC7, montrant que les lymphocytes T de sujets obèses ont la capacité d’altérer la réponse à l’insuline des entérocytes par l’intermédiaire de facteurs solubles. Ces résultats suggèrent que les profils de sécrétion entre les deux groupes de patients diffèrent.
Nous avons donc dosé 13 cytokines par multiplex dans le surnageant de sécrétion basolatéral des lymphocytes T. Ce dosage montre que la co-culture de Caco-2/TC7 avec des lymphocytes de sujets obèses induit une augmentation de la sécrétion de cytokines inflammatoires, l’IFN-γ, l’IL-17 et l’IL-22 étant les plus augmentées dans les surnageants de lymphocytes de LP de sujets obèses par rapport aux sujets minces.
Enfin, pour confirmer l’effet de ces facteurs solubles et évaluer leur impact direct sur la réponse à l’insuline des Caco-2/TC7, nous avons cultivé des entérocytes Caco-2/TC7 en présence de cytokines recombinantes et avons à nouveau évalué la réponse à l’insuline des entérocytes. Cette expérience a montré que les cytokines proinflammatoires (IL-9, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-21, IL-17A et IL-22) altèrent directement la signalisation de l’insuline des entérocytes, l’IL- 17 et l’IL-22 ayant un effet majeur sur celle-ci.
Compartiment basolatéral
LT de sujets minces ou obèses
± anti-CD3/CD28 (activation)
Caco-2/TC7
LT CD3+
Filtre semi-perméable
• Stimulation ou non des Caco-2/TC7 par l’insuline (10 min)
• Mesure de la phosphorylation d’Akt (Akt-P)
• Dosage des cytokines du milieu basolatéral par Luminex (human
Th17 13 plex)
48h
Compartiment apical
65 Conclusion :
Dans l’obésité, l’inflammation contribue à la résistance à l’insuline dans différents tissus cibles (tissu adipeux, foie et muscle) (Olefsky and Glass, 2010). Dans cette étude, nous montrons que l’immunité intestinale est altérée dans l’obésité et que les LT des sujets obèses ont un phénotype plus proinflammatoire par rapport à des sujets minces. Aussi, nous montrons que des facteurs solubles sécrétés par des lymphocytes T intestinaux de sujets obèses et non de sujets minces ont la capacité, in vitro, de diminuer la réponse à une stimulation par l’insuline des entérocytes.
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3. Etude n°2 ̶ Relations entre immunité systémique et immunité intestinale dans