Etude des protéines totales de la graine mature sèche par protéomique shotgun

Cette analyse a été réalisée à partir de i) 300 embryons isolés de graines matures sèches et ii) d’albumen dépourvu d’embryons (1,2 g) également isolé de graines matures sèches d’Amborella (Figure 18 et Figure 20) (cf. « Matériels et Méthodes »). Une approche de protéomique shotgun a été privilégiée car cette technique sensible est particulièrement adaptée pour des échantillons disponibles en très petite quantité, comme c’est le cas pour les embryons d’Amborella (Figure 18 et Figure 20).

L’extraction des protéines totales a permis d’identifier 415 protéines de l’embryon isolé (tableau supplémentaire 1) et 69 protéines de l’albumen débarrassé d’embryons (tableau supplémentaire 2). Les protéines identifiées ont ensuite été regroupées en fonction de leur classe ontologique et de leur description (Bevan et al. 1998).

La représentation de chaque catégorie et de chaque fonction a été exprimée en pourcentage du nombre total de protéines identifiées, ainsi que par rapport à la quantité relative de chaque identification (abondance). Cette estimation a été réalisée à partir du nombre de peptides correspondant à chaque identification (Figure 21).

Les 69 protéines de l’albumen correspondent à 22 fonctions uniques (Bevan et al. 1998). Elles se regroupent en quatre catégories majeures (Figure 21) au regard de leur abondance relative (tableau supplémentaire 2).

La catégorie « destination and storage » contient 19 protéines (27,5% de l’ensemble des protéines) qui représentent 85,1% de l’abondance de l’ensemble des protéines. Huit protéines sont de la fonction « storage protein » (11,6% de l’ensemble des protéines) et représentent à elles seules 82,6% en abondance. La fonction « folding and stability » contient sept protéines (10,1% de l’ensemble des protéines) qui représentent 1,8% en abondance, et la fonction « proteolysis » contient quatre protéines (5,8% de l’ensemble des protéines) qui représentent 0,7% en abondance.

Quinze protéines (21,7% de l’ensemble des protéines) sont de la catégorie « disease/defence » et représentent 5,1% en abondance. Les protéines de la fonction « stress

response », au nombre de cinq (7,2% de l’ensemble des protéines), représentent 2,3% en

abondance. Les protéines de la fonction « detoxification » sont au nombre de six (8,7% de l’ensemble des protéines) et représentent 2,2% en abondance.

Les 17 protéines (24,6%) de la catégorie « energy » représentent 3,6% en abondance. Elles sont principalement impliquées dans trois fonctions, la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques (TCA pathway) et la fermentation et représentent 0,8% d’abondance relative à elles trois.

Les protéines impliquées dans la catégorie « metabolism » sont au nombre de quatre (5,8% de l’ensemble des protéines) et représentent 0,9% d’abondance.

La catégorie « cell structure » contient huit protéines (11,6% de l’ensemble des protéines) qui représentent 1,9% d’abondance.

Ces résultats illustrent clairement que l’albumen, constituant majoritaire de la graine entière, est principalement un tissu de stockage des réserves séminales. Ainsi, la quantité relative de protéines de réserve y est de 82,6%.

Figure 21 : représentation de l'importance des classes ontologiques (Bevan et al. 1998) des protéines totales extraites d'embryon (Embryo) et de l'albumen (Endosperm) de graines stricto

sensu d’Amborella. Les résultats sont exprimés en fonction du nombre de protéines identifiées

par classe par rapport au nombre total de protéines identifiées (%) ou en fonction de leurs quantités relatives parmi l’ensemble des protéines identifiées (A).

La classification par ontologies (Bevan et al. 1998) des 415 protéines identifiées dans l’embryon par approche shotgun est radicalement différente (Figure 21). Ces 415 protéines correspondent à 52 fonctions uniques. Ainsi, les protéines de la catégorie « destination and

storage » qui sont au nombre de 91 (21,9% de l’ensemble des protéines totales identifiées) ne

représentent que 9,5% en abondance (soit près de dix fois moins que dans l’albumen).

La classification ontologique des protéines de l’embryon a par ailleurs permis d’identifier plusieurs catégories majeures (Figure 21) (tableau supplémentaire 1).

La catégorie « metabolism » contient 43 protéines (10,4% de l’ensemble des protéines) et représentent 49,6% en abondance. Dix-sept protéines (4,1% de l’ensemble des protéines) sont impliquées dans la fonction « amino acid » et représentent à elles seules 37,1% d’abondance. Quatorze protéines (3,4% de l’ensemble des protéines) sont impliquées dans la fonction « sugars and polysaccharides » et représentent 7,3% des protéines en abondance. Six protéines (1,4% de l’ensemble des protéines) interviennent dans la fonction « lipid and

sterol » et représentent 1,8% en abondance, quatre protéines sont impliquées dans la fonction

« nitrogen and suplhur » et représentent 2,8% des protéines en abondance, deux protéines sont dans la fonction « cofactors » et représentent 0,6% en abondance.

La catégorie fonctionnelle « energy » contient 44 protéines (10,6% de l’ensemble des protéines) et représente 14,8% en abondance. Notamment, la fonction « glycolysis » contient 17 protéines (4,1% de l’ensemble des protéines) représentant 6,3% en abondance. La fonction « TCA pathway » est représentée par 14 protéines (3,4% de l’ensemble des protéines) qui constituent 4,5% des protéines en abondance. Les fonctions « pentose phosphate » et « fermentation » sont représentées chacune par quatre protéines (1% de l’ensemble des protéines) qui correspondent une abondance de 1,4% et 1,2% respectivement.

Les protéines de la catégorie « protein synthesis » sont au nombre de 51 (12,3% de l’ensemble des protéines) et représentent 8,4% des protéines de l’embryon en terme d’abondance relative. Quarante-deux d’entre elles (10,1% de l’ensemble des protéines) sont de la fonction « ribosomal proteins » et représentent 7,1% d’abondance relative, et neuf protéines (2,2% de l’ensemble des protéines) sont dans la catégorie « translation factors » et représentent 1,3% d’abondance relative.

Ainsi, les protéines de l’embryon sont majoritairement associées aux mécanismes cellulaires plutôt qu’à un rôle de stockage, contrairement à l’albumen (Figure 21).

Une représentation en diagramme de Venn (Figure 22) a permis de mettre en évidence les protéines spécifiques et communes à l’albumen et l’embryon. Ainsi, douze protéines sont

spécifiques de l’albumen, 358 sont spécifiques de l’embryon et 57 sont communes aux deux tissus.

Les protéines spécifiques de l’embryon sont principalement de la catégorie « metabolism » qui représente 33,3% des protéines (en abondance). Notamment, 24,8% sont de la fonction « amino acid », 4,9% de la fonction « sugars and polysaccharides », 2,0% de la fonction «nitrogen and sulfur », 1,2% de la fonction « lipid and stérol » et 0,4% de la fonction « cofactors ». La catégorie « energy » représente 7,0% des protéines spécifiques de l’embryon. La fonction « glycolysis » représente 1,6%, la fonction « pentose phosphate » 1,0% et la fonction « TCA pathway » 2,7%. Il apparaît que les protéines de la catégorie « cell

growth/division – cell cycle » et « protein synthesis » sont spécifiques de l’embryon. La

catégorie « cell growth/division – cell cycle » contient 12 protéines (2,8%) et représente 2% d’abondance. Quatre protéines (0,9%) sont de la fonction « cell cycle» qui représente 0,7% d’abondance. Trois protéines (0,7%) sont de la fonction « DNA synthesis/replication » et représentent 0,5% d’abondance. La catégorie « protein synthesis » contient 51 protéines (11,9%) représentant 6,0% d’abondance. Quarante deux d’entres elles (9,8%) sont de la fonction « ribosomal proteins » et représentent 5,0% d’abondance. Les neuf autres protéines (2,1%) sont de la fonction « translation factors » et représentent 0,9% d’abondance.

Sur les douze protéines spécifiques de l’albumen, cinq sont de la catégorie « cell

structure » et représentent 0,32% des protéines (abondance). Trois d’entre elles sont de la

fonction « cytoskeleton », les fonctions « cell wall » et « ER/Golgi » contiennent une protéine chacune. Les fonctions « lipid and sterol», « mRNA synthesis », « folding and stability », « defence related » et « stress response » contiennent chacune une protéine. La fonction « TCA pathway » contient elle deux protéines.

La grande majorité des protéines communes est de la catégorie « protein destination

and storage » et vient du fait que les protéines de réserves ont été identifiées dans les deux

Figure 22 : diagramme de Venn et signatures ontologiques (Bevan et al. 1998) des protéines totales de l’embryon et de l’albumen de graines stricto sensu d’Amborella identifiées par protéomique shotgun. “P” : répartition des classes ontologiques en fonction du nombre total de protéines identifiées. “A” abondance relative des classes ontologiques identifiées.

2.1.2.2 Analyse des fractions albumines et globulines de la graine mature sèche d’Amborella par électrophorèse bidimensionnelle

L’analyse par protéomique shotgun a montré que les protéines totales de l’albumen sont principalement dominées par les protéines de réserve (82,6% de l’ensemble des protéines identifiées (Figure 21), en accord avec l’observation de la présence de nombreux corps protéiques dans les cellules de l’albumen, contrairement à l’embryon (Figure 20). Par contre, le fait que l’embryon contienne beaucoup moins de protéines de réserve (Figure 20 ; Figure 21) a permis l’identification d’un plus grand nombre de protéines (415) que dans l’albumen (Figure 21). Afin d’analyser plus en détail les fractions albumines et globulines de la graine mature sèche, ces deux fractions ont été séparées selon le protocole d’Osborne (1924) et soumises séparément à une analyse protéomique en 2D-PAGE.