Pour tenter d’identifier des partenaires protéiques du facteur TFIIH dans des cellules prolifératives, 3.107 cellules souches embryonnaires (cellules ES) murines exprimant XPB-YFP-His-HA et de cellules ES sauvages ont été utilisées pour l’essai et pour le contrôle respectivement. Un extrait protéiques total a été obtenu par des cycles successifs de congélation/décongélation des cellules permettant de briser les membranes cellulaires, suivis d’une casse mécanique des noyaux (dounce) dans un tampon contenant 150mM de NaCl et 0,1% de NP-40. Les complexes TFIIH ont ensuite été enrichis et analysés comme décrit précédemment.
L’analyse quantitative de ces immunopurifications a conduit à la quantification de 433 protéines (identifiées et quantifiées avec plus d’un peptide). Le résultat de cette analyse quantitative est représenté figure 46 et table 6.
Figure 46 : Analyse quantitative sans marquage des complexes TFIIH des cellules ES murines représentée graphiquement en traçant les valeurs des log de PAI des protéines quantifiées de l’essai en fonction du contrôle. Les protéines de TFIIH sont représentées par des ronds noirs vides,
ELL par un rond rouge plein, et les partenaires potentiels supplémentaires, constituant le complexe LEC, par des ronds verts plein. Les protéines du bruit de fond sont représentées en bleu.
Parmi les protéines spécifiques de l’essai (situées sur l’axe des ordonnées), on retrouve l’appât XPB identifiée avec un très bon score et quantifiée avec 61 peptides. Les 9 autres sous-unités de TFIIH ont également pu être identifiées et ont été quantifiées comme spécifiques de l’essai. Les trois composants du complexe CAK (MAT1, CDK7 et cycline H) sont très bien identifiés, mais présentent des scores et des PAI légèrement moins élevés que les protéines du cœur (ce qui paraît cohérent puisque le CAK est connu pour s’associer de façon plus transitoire au complexe cœur dont fait partie l’appât). Au final, les dix sous-unités de TFIIH ont été identifiées et quantifiées spécifiquement dans l’essai avec de très hauts scores et de très nombreux peptides, et font partie des protéines les plus abondantes de l’échantillon. Seule TTD-A, la dixième sous-unité, a été identifiée avec un plus faible score qui peut s’expliquer par la petite taille de la protéine (8kDa) mais
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97 également par son interaction dynamique avec TFIIH (Giglia-Mari, Miquel et al. 2006). L’immunopurification réalisée a donc permis un très bon enrichissement du complexe, qui peut être facilement distingué des protéines contaminantes quantifiées avec un ratio centré autour de 1.
Table 6 : Protéines d'intérêt identifiées après analyse protéomique quantitative des complexes TFIIH au sein des cellules ES murines. 4 réplicats ont été réalisés. (AC : numéro
d’accession, MM(Da) : masse moléculaire en dalton, QPep : nombre de peptides quantifiés).
Par ailleurs, parmi les protéines spécifiques de la condition essai, certaines sont identifiées avec de bons scores et sont relativement abondantes (PAI élevés) et représentent ainsi des partenaires potentiels de TFIIH. On retrouve dans ces protéines candidates, la protéine XPG, une endonucléase connue pour interagir avec TFIIH et jouant un rôle dans la réparation de l’ADN de type NER (Ito, Kuraoka et al. 2007). Une autre protéine d’intérêt biologique semble interagir de façon spécifique avec TFIIH, le facteur ELL (Eleven-nineteen lysine-rich leukemia protein). C’est un facteur d’activation d’élongation de l’ARN polymérase II qui permet d’augmenter son activité d’élongation en réduisant le taux de RNAP2 en pause au niveau des promoteurs (Shilatifard, Lane et al. 1996). Elle a été identifiée comme composant d’un complexe d’élongation de la transcription des ARNm, le SEC (« super elongation complex ») (Lin, Smith et al. 2010). Parmi les protéines du SEC, seule Eaf1, un partenaire connu de ELL (Simone, Polak et al. 2001), a été identifiée dans nos analyses. ELL a également récemment été décrit comme membre d’un autre complexe, le LEC (« little elongation complex »), qui jouerait un rôle dans l’élongation de la transcription des snRNA (« small nuclear RNA ») (Smith, Lin et al. 2011; Takahashi, Parmely et al. 2011) Le LEC est composé de ELL, Eaf1 et de deux protéines de fonction jusque-là inconnue, KIAA0947 et Narg2, que nous avons également identifiées ici comme spécifiques de l’essai. Pour conforter les résultats obtenus, trois réplicats biologiques supplémentaires ont été réalisés. Seules XPG, ELL et KIAA0947 sont retrouvées systématiquement comme partenaires de TFIIH (Table 6). Cependant, certaines protéines comme Narg2 et Eaf1, bien que non identifiées dans les 4 réplicats, apparaissent spécifiques de l’essai lorsqu’elles sont identifiées, avec un PAI proche de certains composants de TFIIH et présentent de très bons scores. Elles sont de fait des partenaires potentiels de TFIIH.
AC Protéine Description de la protéine Gène Score essai (4
réplicats)
Score CT (4 réplicats)
Qpep
(4réplicats) Ratio IP/CT
P49135 XPB TFIIH basal transcription factor complex helicase XPB subunit ERCC3 6682;5845;1848;2886 -;-;-;- 61;60;16;34 Spécifique IP Q8C487 XPD TFIIH basal transcription factor complex helicase XPD subunit ERCC2 1624;1074;1394;1496 -;-;-;- 32;24;23;35 Spécifique IP Q9DBA9 p62 General transcription factor IIH subunit 1 Gtf2h1 3426;2422;6116;2086 -;-;-;- 40;36;21;30 Spécifique IP O70422 p52 General transcription factor IIH subunit 4 Gtf2h4 3191;2045;9115;2741 -;-;-;- 26;27;17;21 Spécifique IP Q9JIB4 p44 General transcription factor IIH subunit 2 Gtf2h2 2113;1691;8476;2268 -;-;-;- 30;25;16;25 Spécifique IP Q8VD76 p34 General transcription factor IIH subunit 3 Gtf2h3 1886;1424;1408;1473 -;-;-;- 16;16;13;15 Spécifique IP Q8K2X8 TTD-A General transcription factor IIH subunit 5 Gtf2h5 140;179;-;- -;-;-;- 1;2;-;- Spécifique IP P51949 MAT1 CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Mnat1 874;582;2480;1174 -;-;-;- 16;11;13;17 Spécifique IP Q03147 CDK7 Cell division protein kinase 7 Cdk7 707;185;2411;860 -;-;-;- 11;3;15;15 Spécifique IP Q3UUW5 Cyclin H Cyclin-H Ccnh 557;181;1027;583 -;-;-;- 11;4;12;18 Spécifique IP Q3UV64 XPG DNA repair protein complementing XP-G cells homolog ERCC5 2016;1196;550;793 -;-;-;- 36;26;18;27 Spécifique IP O08856 ELL RNA polymerase II elongation factor ELL ELL 853;427;101;119 -;-;-;- 19;12;5;4 Spécifique IP Q9D4C5 EAF1 ELL-associated factor 1 Eaf1 658;146;-;- -;-;-;- 3;4;-;- Spécifique IP Q6ZQ20 KIAA0947 KIAA0947 protein mKIAA0947 878;224;79;272 -;-;-;- 17;5;3;4 Spécifique IP Q3UZ18 NARG2 NMDA receptor-regulated protein 2 Narg2 703;168;-;- -;-;-;- 17;5;-;- Spécifique IP
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Etude du rôle de ELL au sein du complexe TFIIH
Des études plus approfondies ont été réalisées dans l’équipe de G. Gigli-Mari pour comprendre le rôle joué par le facteur d’élongation de la transcription ELL en association avec TFIIH. Pour confirmer et préciser l’interaction d’ELL avec TFIIH, des expériences complémentaires de GST pull-down ont tout d’abord été effectuées à l’aide de protéines recombinantes, montrant qu’ELL interagit spécifiquement in vitro avec CDK7, et pourrait donc représenter un nouveau constituant du complexe CAK. Grâce à des expériences de FRAP réalisées sur des fibroblastes humains exprimant ELL-GFP, XPB-GFP et CDK7-GFP, la dynamique d’association à la chromatine de ces différentes protéines a été mesurée, à la fois après inhibition de la transcription ou en réponse à un dommage de l’ADN induit par UV. Ces mesures indiquent que la protéine ELL présente une mobilité et une dynamique d’association à l’ADN similaire au complexe CAK, suggérant qu’elle pourrait appartenir à ce complexe in vivo et jouer un rôle dans la réparation de l’ADN de type NER. Enfin, des expériences fonctionnelles réalisées après répression d’ELL ou CDK7 par siRNA ont effectivement montré in vivo un nouveau rôle de la protéine ELL dans la réponse aux dommages de l’ADN au cours de la TCR. Plus particulièrement, l’équipe de G. Gigli-Mari a montré que ELL, associée à TFIIH, facilite la reprise de la transcription par la RNAP2 après réparation des lésions. L’ensemble de ces études est détaillé dans une publication en préparation intégrée à la fin de ce chapitre.
II-4. Discussion et conclusion
Nous avons au cours de cette étude étudié les partenaires protéiques du facteur TFIIH dans les cellules ES murines. L’analyse du complexe TFIIH s’est révélée plus facile que celle des complexes THAP, traduisant probablement une plus grande stabilité du complexe, mais également peut-être une meilleure pertinence du modèle biologique utilisé, et une meilleure efficacité de l’immunopurification à l’aide des anticorps GFP-trap. Du point de vue de l’analyse protéomique, l’élimination du préfractionnement par gel SDS-PAGE a permis de réduire considérablement le temps d’analyse, et de tester plus facilement différentes conditions expérimentales de purification des complexes. L’analyse quantitative s’est révélée utile pour mettre facilement en évidence les dix sous- unités de TFIIH, et dégager des partenaires spécifiques. L’un d’entre eux est la protéine XPG, dont l’interaction avec TFIIH a déjà été plusieurs fois reportée (Ito, Kuraoka et al. 2007) corroborant ainsi nos résultats. Un autre partenaire potentiel apparaissant clairement d’après les données protéomiques est la protéine ELL, et des expériences biologiques menées par la suite ont permis de valider ELL comme un partenaire fonctionnel in vivo. La fonction des autres partenaires potentiels identifiés reste à déterminer.
L’un des objectifs initial de l’étude était par ailleurs de comparer les interactants de TFIIH dans différents contextes cellulaires, notamment dans des cellules prolifératives et dans des cellules post-mitotiques différenciées, de façon à expliquer la différence de mobilité de TFIIH sur la chromatine. Des premières analyses protéomiques ont été réalisées sur des complexes TFIIH immunopurifiés à partir de tissus (cerveaux de souris). Dans ces échantillons, nous avons pu à nouveau identifier la totalité des sous-unités du facteur TFIIH et mettre en évidence son interaction avec XPG, mais aucun autre partenaire potentiel n’a pu être clairement caractérisé grâce à ces expériences. Typiquement, la protéine ELL n’a pas été identifiée. Des expériences complémentaires devront être réalisées pour confirmer éventuellement que la protéine ELL n’est pas recrutée dans ce type de cellules. Par ailleurs, les conditions de préparation des complexes à partir de tissus devront
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99 éventuellement être adaptées pour identifier des interactants interagissant plus faiblement ou de façon plus transitoire avec TFIIH.