1) Ségrégation Fl et maintien de l'état hybride du génome
L'étude de la ségrégation des locus microsatellites au cours de la méiose Fl a permis de montrer une ségrégation mendélienne quasi normale.
Toutes les ségrégations hybrides ont montré que les allèles des deux espèces parentales, amplifiés grâce à une paire d'amorces spécifiques, s'excluent l'un l'autre. Ainsi l'absence de ségrégations non mendélienne entre allèles O. niloticus et S. melanotheron et la
recombinaison observée entre les locus liés chez les espèces pures permettent de supposer l'homologie des locus amplifiés chez les deux espèces et donc une structure caryologique et chromosomique proche entre les deux espèces parentales permettant un appariement correct de chromosomes homologues et la réalisation de crossing-over.
De plus le très faible nombre de distorsions de ségrégation observé sur l'ensemble des locus et des géniteurs tendrait à confirmer la transmission mendélienne des allèles des deux espèces parentales à la génération suivante, ce qui entraînerait le maintien au travers de la méiose d'un pool génique hybride stable (50% d'allèles O. niloticus, 50% d'allèles
S. melanotheron).
D'autre part les phénomènes de distorsion décrits par Palti et al. (1999) pour les locus
UNH-159 et UNH-216 n'ont pu être vérifiés ici. En effet, UNH-159 ne présente aucune distorsion sur l'ensemble des ségrégations étudiées et UNH-216 n'en présente qu'une seule significative. Ainsi l'hypothèse de l'allèle létal lié à ces 2 locus semble peu probable dans notre cas, même si celui-ci peut exister dans la souche utilisée par cet auteur.
Toutefois quelques distorsions ont été observées chez les mâles hybrides réciproques (FI et F' 1 ). La descendance de chacun d'eux présente un déficit des allèles provenant du grand-père paternel (mâle FI (N x M), déficit d'allèle M et mâle F' 1 (M x N), déficit d'allèle N). Ainsi cette perte a lieu pour les allèles du génome en opposition avec le milieu cytoplasmique de l' hybride FI (lors de la fécondation). Même si elle est limitée, cette observation est cohérente
avec les cas connus d'élimination sélective de chromosomes chez des hybrides, qui affecte le plus souvent les chromosomes d'origine paternelle (Fujiwara et al., 1997).
Cependant, ceci n'a pu être mis en évidence que de manière globale et limitée (P = 5%), l'écart des locus pris indépendamment étant bien inférieur au seuil de signification. L'existence de ce phénomène devra tout de même être vérifiée et suivie lors des méioses ultérieures (F2, ... , Fn) car, bien que marginal, il pourrait engendrer tout au long des générations un déplacement de la structure hybride du pool génique constitué par l'ensemble des individus hybrides.
Par ailleurs, les cas d'amplification de plus de deux allèles par individu ont pu être confirmés lors du génotypage des descendants pour les locus UNH-135 et UNH-197. L'étude de leur génotype a révélé la coségrégation stricte de certains allèles qui confirme l'hypothèse d'écho. Ainsi certains allèles présentent un pattern d'amplification à deux ou trois « bandes » par allèle, ce qui revient à une ou deux copie(s) des sites d'amorçage. Aussi aucun locus microsatellite étudié ici ne présente de duplication. Cependant certains locus n'ayant pu être mis au point correctement, à cause d'un grand nombre de « bandes » amplifiés, comme UNH-111, pourraient présenter une telle duplication comme l'ont proposé Palti et al. (1999).
Seulement le grand nombre d'allèles en commun chez les deux parents (patterns multi bandes) ne permet pas d'établir de manière ngoureuse la ségrégation conjointe ou indépendante des différents allèles. Ainsi, bien que cette hypothèse de duplication soit plausible, celle d'amplification aspécifique forte l'est également.
D'autre part les phénomènes de mutation mis en évidence lors de trois ségrégations de la .1o�e füme!!e (UNH- 1 24 / Br.J. n=l ; UNH-1 3 � / BC9, n=4 et UNH-21 1 / BC5bis, n=l) ont montré des taux de mutations très élevés si l'on considère les locus indépendamment les uns des autres (entre 2 et 8%). Seulement sur l'ensemble des locus étudiés, ceux-ci ne s'avèrent plus aussi important. Le séquençage des allèles parentaux nouvellement observés pourrait permettre de comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la création de nouveaux allèles.
2)Déséquilibre de liaison
Avec le panel de marqueurs utilisé pour l'étude de la ségrégation hybride, 11 liaisons étaient attendues d'après la carte génétique de O. niloticus publiée par K ocher et al. (1998)
pour la voie femelle. Celles-ci ont toutes pu être vérifiées à l'exception de deux :
(1 ) UNH-102 et UNH-138, appartenant au groupe de liaison 16, n'ont montré qu'une seule liaison significative pour un LOD compris entre 2 et 3. Ceci peut s'expliquer par une distance génétique assez grande entre ces deux marqueurs ( 43, 1 cM selon Kocher et al.
(1998)). L'étude de la liaison avec les autres marqueurs appartenant à ce groupe pourrait confirmer l'existence de cette liaison.
(2) UNH-008 et UNH-103, deux seuls marqueurs constitutifs du groupe de liaison 17 séparés de 5 cM d'après la carte génétique O. niloticus, ne montrent aucun cas de
liaison. De plus UNH-008 s'est trouvé lié dans tous les cas de ségrégation testés avec UNH-146 affecté jusqu'ici au groupe de liaison 4. Ceci peut s'expliquer par le fait que ces deux groupes de liaison n'en forment finalement qu'un seul ou bien qu'un ou plusieurs locus de ces groupes y aient été assignés sans qu'ils n'y soient réellement liés. Dans ce cas, soit UNH 008 et UNH 146 sont réellement positionnés sur le groupe de liaison 4, soit sur le 17 ou bien sur un nouveau groupe de liaison indépendant des 2 autres.
Des différences pourraient exister au niveau de la position de certains locus dans le génome de O. niloticus entre les différentes souches étudiées. En effet la souche utilisée ici
l 'h h . ,l . 11 d 1 . ri B k ' (r.A d'T . ) . , 1
pot:r , y vrt.. . .cat1on est ce. e e ,a station -e oua .e , _.ote . voire qm presente a
particularité de résulter d'un mélange entre une souche du Nil et une souche de la Volta. Ceci lui confère un génome bien particulier montrant une grande variabilité (Rognon et al. , 1996 et
Rognon & Guyomard, 1997), qui peut être dû à des translocations réciproques ayant eu lieu au sein de ces deux populations originales, avant le mélange, ce qui peut avoir modifié les liaisons observées par Kocher et al. (1998).
Par ailleurs, la comparaison des déséquilibres de liaison observés a montré des résultats homogènes des ségrégations pures entre voie mâle et femelle O. niloticus. Ainsi il semblerait ne pas y avoir de différence de taux de recombinaison entre sexes chez les tilapias, contrairement à ce qui est observé pour les Salmonidés, autre groupe de poissons fortement étudié chez lesquels les mâles recombinent beaucoup moins que les femelles (Johnson et al.,
1987) (cette différence de taux de recombinaison entre sexes chez les Salmonidés semble toutefois être une exception chez les poissons).
D'autre part les résultats obtenus à partir de la fratrie pure S. melanotheron se montrent fort intéressants. En effet toutes les liaisons attendues d'après la carte O. niloticus qui ont pu être testées se sont révélées significatives à l'exception de celle entre UNH-1 02 et UNH-138 qui n'a pu également être clairement établie pour O. niloticus.
Il en va de même concernant les déséquilibres de liaison observés chez les hybrides. De plus les taux de recombinaison obtenus ne semblent pas diverger de ceux observés chez les espèces pures. Aussi dans notre étude nous ne pouvons pas observer de « rétrécissement »de la carte génétique dû à l'état hybride comme nous aurions pu l'attendre.
Ceci permet de confirmer les résultats obtenus précédemment en montrant la proximité de structure des génomes des deux espèces impliquées dans le programme d'hybridation.
Conclusion et perspectives
Cette étude constitue 1 'une des premières phases du programme d 'Hybridation Intergénérique chez les Tilapias mené par le CIRAD. Au cours de celle-ci, nous avons pu mettre au point un panel de marqueurs microsatellites adaptés à l 'analyse de ségrégations hybrides, non seulement entre O. niloticus et S. melanotheron mais également entre d'autres espèces de tilapias, comme O. mossambicus.
En effet les tests d'amorçage interspécifique ont montré, sous réserve d'homologie, une forte conservation de locus sur l 'ensemble des espèces de tilapias testées et au-delà pour les autres espèces de Cichlidés africains, ce qui permet leur utilisation lors de l'étude concernant d'autres espèces.
Cette étude de la conservation de l'amplification et du polymorphisme des locus microsatellites pourrait être poursuivie dans plusieurs voies
Tout d'abord, le panel d'espèces pourrait être augmenté par des espèces appartenant aux groupes de Tilapiinés non encore échantillonnés, ainsi que par des espèces plus éloignées appartenant aux autres grands groupes de Cichlidés africains (Haplochrominiens, Lamprologiens, . . . ) (Streelman et al. , 1 998) ou néotropicaux (Cichlasomines, . . . ). Ceci nécessiterait un travail d'ajustement important des conditions d'amorçage hétérologue afin d'obtenir des taux d'amplification qui ne soient pas trop sous-estimés.
D 'autre part, le séquençage des allèles amplifiés chez les différentes espèces permettrait de confirmer ( ou non) de manière non-équivoque leur homologie. Ceci permettrait de plus,
i )�tt.:dt de ieurs n1odes de rnutatior1 et 1 'analyse d�: } c�°':olu!icn de leur structure- aussi hien ait
niveau des régions répétées que des régions flanquantes.
Ainsi malgré les problèmes méthodologiques rencontrés actuellement, ces marqueurs microsatellites pourraient permettre une étude phylogénétique de ces groupes de Cichlidés. Notamment ceci pourrait permettre de tester la monophylie des genres Oreochromis et
Sarotherodon, hypothèse émise par Trewavas (1983) et controversée par Peters et Berns (1 982), selon lesquels plusieurs lignées d'incubateurs buccaux seraient apparues à différentes époques à partir d 'ancêtres pondeurs sur substrat ; les incubateurs buccaux ne devraient donc pas être séparés en Oreochromis spp. et Sarotherodon spp. mais en incubateurs « anciens » et « récents » classés dans le genre Tilapia.
D'autre part l'étude des ségrégations hybrides a permis de caractériser la méiose Fl pour les deux sens de croisement originaux (Fl et F'l) et pour chaque sexe. Celle-ci a pu être comparée avec la méiose pure des deux espèces parentales. De plus les déséquilibres de liaison observés ont pu être confrontés avec. ceux établis par Kocher et al. (1998), montrant la conservation des groupes de liaison, l'affectation de trois nouveaux locus à des groupes préexistant mais également deux ruptures de liaison. Ceci laisse supposer une certaine variabilité structurale du génome des populations O. niloticus mais surtout la possibilité de développer un programme de cartographie comparée O. niloticus / S. melanotheron.
Les ségrégations observées ici ont montré une ségrégation mendélienne proche de la normale et une recombinaison des caractères intéressants des espèces parentales, qu'il conviendra bien sûr de réaliser et de stabiliser. Toutefois de faibles déséquilibres ont pu être mis en évidence dans la descendance des mâles hybrides montrant une perte d'allèles du grand-père. L'étude de réplicats et la suivie des descendances ultérieures (F3, . .. , Fn) permettraient d'éclaircir ce point.
Aussi cet hybride entre O. niloticus et S. melanotheron représente un modèle théorique intéressant pour l'étude de l'évolution des génomes au cours de phases d'hybridation. Celle-ci pourrait être également complétée par des aspects morphologique et caryologique (Hybridation Génomique In Situ - GISH) afin d'étudier les implications des phénomènes d'hybridation aux différents niveaux d'intégration de l'organisme.
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Annexe 1 : Liste de l'ensemble des locus mj_�rosatellites utilisés : le groupe de liaison, le motif, la structure et la taille sont observés chez O.
niloticus ( d'après Kocher et al. , 1 998) ; en italique les locus exclus lors de la mise au point, en caractères droits les locus utilisés pour les
tests d'amorçage interspécifique et en gras ceux utilisés également pour l'étude de la ségrégation hybride.
groupe Taille Conditions No
Locus de Motif microsatellite structure
(pb) PCR Séquences des amorces ( 5' -3' ) Accession
liaison GENBANK
UNH-008 1 7 [AACJn pure 222 R* 58/1 ,2/30 F AGC GCC ACT CTT TGT CC G31 346
R GCG GGT GAT CTG CTG TC
UNH-1 02 1 6 [CAJn pure 1 45 R* 50/1 ,2/30 F AAA TGA TAC ATG ACT GCT TA G1 2255
R TT A GGA CTT ATC TGT CTA CAA GC
UNH-1 03 1 7 [CAJn pure 1 93 R* 48/1 ,5/30 F CAA TGT CCA TCC TTC CT G1 2256
R CTG TCT GAG TGC AAA TGT AA
UNH- 105 [CAJn pure 129 R* 6011, 2130 F AGA CAT CAC GA T AAA ATA TCA TA G 12258
R CAT A TA A TA CAC AGG TTA CAT GC
UNH-1 06 1 4 [CTJn-[CAJn composé 1 34 R* 50/1 ,2/30 F CGT TCA GCA TCC GTA TAT G 1 2259
R GTC TCT TTC TCT CTG TCA CAA G
UNH-109 [CA} n -{C7] n -[CA] n -{C 7] ,, -[AT composé 177 R* 60/1130 F GAT ATC GA T TTT CCC GT G 12262
R CA T AA T ACT CCA TCA CTT TTA CC
UNH- 1 1 1 7 [CAJn pure 192 F* 58/1,2130 F TGC TGT TCT TA T TTT CGC G 12264
R A TA AGA GTG TA T GCA TTA CTG G
UNH-1 1 5 3 [CAJn-[CGJn-[CAJn composé 1 49 F* 50/1 ,5/30 F ACC TTC ATC TCG GTC AG G1 2268
R TCA AGC AGC TGA TTT TT
UNH-1 1 7 [CAJn interrompu 1 1 8 R* 5211, 2130 F TGA AA T GCA TGA TCA AA G 1 2270
R AGA GAG GAG AGT A TT T AA GTT TG
UNH-120 1 8 [CAJn-[T AJn-[CAJn composé 1 60 R* 48/2/30 F T AA GGC TCT A TG TGG TC G1 2273
R TT A AAG GGG AAG AAA GA
UNH-1 23 1 2 [CAJn pure 1 97 F* 48/1 ,2/30 F GAT GAT CAC AGA CAG A TT AGA G1 2276
R GAT TGA GAT TTC ATT CAA G
UNH-1 24 [GTJn pure 1 60 F* 56/1 ,2/30 F AA T TTG GCA GCT TCT TTT G1 2277
R CCC ACA AGC ATA GTA AAC T
UNH-1 25 1 6 [CAJn-[T AJn composé 1 56 R* 48/1 ,5/30 F GCT ATC TAC CTA CCT ACC TGT G1 2278
R TCA TTC TTT CAC AAA TGT TTC TA
UNH-1 29 8 [CAJn interrompu 1 93 R* 52/1 ,2/30 F AGA AGT CGT GCA TCT CTC G1 2282
Annexe 1 : Liste de l'ensemble des locus mi,.;rosatellites utilisés : le groupe de liaison, le motif, la structure et la taille sont observés chez O.
niloticus ( d'après Kocher et al. , 1 998) ; en italique les locus exclus lors de la mise au point, en caractères droits les locus utilisés pour les tests d'amorçage interspécifique et en gras ceux utilisés également pour l'étude de la ségrégation hybride.
groupe Taille Conditions No
Locus de Motif microsatellite structure
(pb) PCR Séquences des amorces ( 5' -3' ) Accession
liaison GENBANK
UNH-1 30 23 [CAJn pure 1 91 R* 50/1 ,2/30 F AGG AAG AAT AGC ATG TAG CAA GTA G 1 2283
R GTG TGA TAA ATA AAG AGG CAG AAA
UNH-1 31 3 [CAJn pure 1 94 F* 48/2/30 F CAG AA T CAA en ITG GA G1 2284
R GTG AIT
m
AAA TAG ACC ne ACT AUNH-1 32 9 [GAJn pure 1 1 3 R* 54/1 ,2/30 F ATA TAA GAA ACT GAG TCG GTG AG G1 2285
R TGG AAA TAG AGG GTG GGT GAG
UNH-1 35 3 [CAJn interrompu 1 57 R* 50/1 ,5/30 F TAT GTG TGT GAA GGC ITT T G1 2287
R CTC TGA CTA TAT GTC TAT AGC TGG
UNH-1 38 1 6 [CAJn pure 1 96 R* 48/1 ,5/30 F ne AGC ne A Te TCT TG G1 2290
R eeA TIT TAA CCT CTC CAT CT
UNH-1 42 [CAJn interrompu 1 70 F* 48/1 ,2/30 F en TAC GIT GACGeA GT G1 2294