Etude de l’exposition sur une semaine

Aux vues de l’utilisation des nanoparticules de silice en cosmétique, il nous a semblé important de ne pas se limiter à une exposition de 24 heures comme c’est le cas dans la plupart de études. Les impératifs de la culture cellulaire nous ont fait limiter l’exposition à 7 jours, délai au-delà duquel il est nécessaire de renouveler le milieu de culture afin que les cellules aient tous les nutriments nécessaires à une prolifération normale.

3.2.1 L

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Les premières informations ont été obtenues par microscopie à fluorescence. Après 48 heures d’exposition, les photos montrent que les particules Si+60 et Si+200 sont présentes en grand nombre dans des vésicules – comme l’atteste la présence de nombreux points bleu clair traduisant la superposition du signal de la FITC et du Lysosensor – sans dommage apparent sur la morphologie des cellules (figure 3.8 a-b). De plus, aucun signal de la FITC n’est visible au niveau du noyau. Au contraire, les cellules exposées aux nanoparticules de 10 nm, positives ou négatives, sont très peu nombreuses et très endommagées (figure 3.8 c-d), comme l’atteste la présence de cellules de forme arrondie (figure 3.8 d), caractéristique de cellules n’ayant plus que très peu de points d’adhésion et sur le point de mourir.

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Par ailleurs, le suivi de l’intensité du signal intracellulaire de la FITC (figure 3.3) montre que les particules Si+200 et Si+60 s’accumulent dans les cellules pendant 4 jours avant que le signal de la FITC ne commence à diminuer. Cette perte de signal indique qu’il y a moins de FITC dans les cellules après 4 jours. Deux causes sont possibles : soit les particules ressortent des cellules, soit les particules sont partiellement dégradées dans les cellules et la fluorescéine libérée sort des cellules. On observe aussi cette diminution du signal de la FITC dans les cellules exposées aux particules Si+10 et Si-10, à la différence que cette perte de signal est plus rapide et commence respectivement après 3 jours et 24 heures. Dans ce dernier cas, la perte de signal pourrait être due non pas à une libération contrôlée des particules ou de la fluorescéine mais plutôt à une fuite de ces dernières suite aux dommages causés par les particules sur la membrane cellulaire. De plus, les résultats du signal de fluorescence pour les cellules exposées aux nanoparticules Si+10 et Si-10 au-delà de 24 heures peuvent être faussés par le nombre restreint de cellules observables.

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Enfin, pour visualiser plus en détail la localisation intracellulaire des particules Si+60 et Si+200, les cellules fixées ont été observées en MET. On observe effectivement une préservation de l’intégrité de la membrane des cellules exposées une semaine aux particules Si+200. On note aussi que des agrégats de particules sont toujours présents dans des vésicules (figure 3.9 a-b). Par rapport aux photos à 24 h, on peut voir la présence de nombreux lysosomes, ainsi qu’une modification de l’aspect des nanoparticules internalisées qui apparaissent avec une structure interne poreuse ou fragmentée (figure 3.9 b). Cette modification de la structure des particules pourrait être due à des phénomènes de dégradation intracellulaire. On retrouve cet aspect sur les nanoparticules Si+60 internalisées (figure 3.9 d). Cependant, la structure interne des cellules est plus affectée que dans le cas des particules Si+200.

3.2.2V

L’étude de la toxicité des différentes nanoparticules sur une semaine montre une évolution dans la continuité des résultats à temps court (figure 3.10) et conforme aux observations de microscopie quant à la morphologie des cellules exposées aux nanoparticules. En effet, on

observe pour les particules Si+60 et Si+200 une activité métabolique comparable au témoin après 7 jours d’exposition et une densité cellulaire similaire pour Si+200 et supérieure pour Si+60.

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En ce qui concerne les particules de 10 nm de diamètre, les tendances observées à 24 heures se confirment. Les particules Si-10 à 0,6 mg/mL induisent une très forte perte cellulaire et une activité métabolique réduite. Lorsque la concentration de ces nanoparticules est divisée par 10 (expérience à 0,06 mg/mL), l’évolution est différente. On peut ainsi noter que la densité cellulaire après 7 jours d’exposition est comparable au témoin, même si l’activité métabolique reste légèrement inférieure à celle des cellules témoins. Enfin, les particules Si+10 ont, elles aussi, un effet néfaste sur la densité cellulaire mais dans des proportions moindres. On observe effectivement une baisse du nombre de cellules exposées à une concentration en particules Si+10 de 0,6 mg/mL. Cependant après 7 jours il y a encore environ 30% de la population observée avec les cellules témoins. L’activité métabolique suit la même évolution : elle est plus faible que pour les cellules témoins mais reste plus importante que dans le cas des cellules exposées aux particules Si-10. De même qu’une diminution de la concentration en Si-10 limite les effets toxiques, les cellules exposées à 0,06 mg/mL de particules Si+10 sont nettement moins perturbées par la présence des particules. Ainsi observe-t-on que l’activité métabolique dans ces conditions est comparable à celle des cellules témoins, la seule différence notable est la densité cellulaire légèrement inférieure.

De cette étude on peut donc conclure que jusqu’à une semaine d’exposition les particules positives de 60 nm et 200 nm ne présentent pas de toxicité notable pour les fibroblastes. A l’opposé, les particules de 10 nm, positives ou négatives, ont un effet néfaste sur les cellules, effet d’autant plus marqué pour les particules négatives. L’analyse simultanée de l’activité métabolique et du nombre de cellules vivantes montrent que les cellules survivant à l’exposition aux nanoparticules de 10 nm de diamètre ne répondent plus à cette situation de stress et retrouvent après une semaine une activité métabolique en accord avec le nombre de cellules. Enfin ces effets toxiques sont très nettement atténués lorsque la concentration en nanoparticules Si+10 et Si-10 est divisée par dix, pour se ramener à un nombre de particules comparables à Si+200.

3.2.3B

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7

Comme il a déjà été souligné, de nombreuses études existent sur l’internalisation de particules de silice. Cependant, la majorité de ces études concerne des particules de silice mésoporeuses, considérées comme de bons candidats pour une utilisation comme vecteurs de principes actifs. Bien que non mésoporeuses, les particules utilisées présentent une microporosité qui dépend des conditions de synthèse. Dans ce cadre, il peut être intéressant de confronter nos résultats à ceux obtenus pour des particules mésoporeuses. En effet, plusieurs études ont montré que la porosité des particules est un facteur déterminant pour la toxicité (Rabolli 2010, Yu 2012). Par ailleurs la variabilité des lignées cellulaires utilisées dans ces études ne permet pas de comparaison facile puisqu’en fonction de la nature des cellules et de leur taux de prolifération l’effet de la silice peut être variable (Absher 1980, Chang 2007).

Malgré tout, on peut souligner que l’internalisation dans des endosomes de nanoparticules de 50 à 200 nm de diamètre, sans toxicité significative, a déjà été observée dans différentes lignées cellulaires (Napierska 2010). Dans notre cas, on observe que les particules de 60 nm positives se comportent globalement comme les particules Si+200 en terme d’internalisation et de toxicité. Par ailleurs, quelles que soient les cellules, les nanoparticules les plus petites présentent une toxicité accrue, notamment en-dessous de 20 nm de diamètre (Yu 2009). Ceci est cohérent avec nos observations sur les particules de 10 nm positives qui ont un effet toxique notable et causent des dommages importants aux cellules (à concentration massique identique avec Si+200). Il semble donc qu’il y ait un seuil de taille critique dans la nature des

interactions nanoparticules-cellules (NHDF) à concentration massique en nanoparticules constante.

De plus, on peut noter que les particules Si-10 causent plus de dommages que les particules Si+10. Cependant, il faut se souvenir que dans le milieu de culture, les particules s’entourent d’une couronne de protéines qui modifie leur charge de surface globale (cf chapitre 2) ainsi que la nature chimique de la surface. Les particules Si+10 sont globalement neutres dans le milieu de culture tandis que les particules Si-10 sont réellement négatives, ce qui entraîne des interactions différentes avec la membrane cellulaire, elle-même chargée négativement. Ces observations sont en accord avec d’autres études qui montrent que le greffage d’amines en surface des particules de silice diminue leur toxicité (Chang 2007, Yamashita 2011).

Enfin, une observation importante de cette étude est la diminution du signal de la FITC intracellulaire, résultat d’une libération des particules et/ou de fluorescéine obtenue par dissolution intracellulaire des particules. L’exocytose de nanoparticules de silice a déjà été rapportée (Stayton 2009, Hu 2011), mais sans forcément tenir compte de leur possible dissolution intracellulaire. C’est pour tenter de mieux connaître le devenir à long terme des ces particules que l’étude a été poussée plus loin.