B- STRATEGIE UTILISEE
8.2. ETUDE DE L’ACTIVITE IN VITRO DES EXTRAITS SUR M. ULCERANS
L’objectif visé ici était d’évaluer l’activité antimycobactérienne de nos extraits de plantes in vitro sur M. ulcerans. Pour ce faire, nous avons dû mettre au point un test rapide d’évaluation in vitro d’activité d’extraits végétaux sur M. ulcerans.
Les résultats obtenus sont repris dans la publication suivante: Buruli ulcer: A review of in vitro tests to screen natural products for activity against Mycobacterium ulcerans (Yemoa; 2011).
Nous n’avons relevé sur pubmed aucune publication en rapport avec les tests in vitro d’évaluation d’activité d’extraits de produits naturels sur M. ulcerans. Dès lors nous nous sommes focalisés sur ceux utilisés avec succès pour évaluer la sensibilité de mycobactéries (M. tuberculosis, M. smegmatis, M. marinum) aux antibiotiques comme aux extraits de produits naturels (Cos; 2006, Portaels; 1998, Bueno-Sanchez; 2010, Palomino; 2002, Martin; 2007, Pavan FR ; 2010).
Les méthodes utilisées in vitro pour le screening antibactérien sont classifiées en trois groupes: méthodes de diffusion, dilution, et radiorespirométrique. Puisque M. ulcerans a une croissance lente, ces méthodes générales doivent être adaptées à ses conditions de culture (temps d’incubation long, température d’incubation de 30-32°C, présence de CO2pour les milieux gélosés) afin d’avoir une méthode sensible, spécifique avec des résultats interprétables.
La méthode de diffusion, première méthode développée pour les tests antibactériens (Bueno-Sánchez; 2010) utilise en général des disques de diffusion sur le milieu gélosé fait à base d’agar. Cette méthode est qualitative et ne permettra pas de dire à quelle concentration il y a inhibition de la croissance de M. ulcerans. De même les composés non polaires diffusent plus lentement que les composés polaires dans le milieu gélosé et, par conséquent, donnent une plus faible activité pour ces
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derniers. Donc, la méthode de diffusion n'est pas appropriée pour tester des extraits contenant des composés non-polaires ou des composés qui ne diffusent pas facilement dans la gélose. Cela a aussi pour conséquence que les activités des composés antimicrobiens des différents échantillons ne peuvent pas toujours être comparées, principalement en raison de différences de propriétés physiques, telles que la solubilité, la volatilité et les caractéristiques de diffusion dans l'agar. En outre, la méthode d’agar-diffusion n’est pas utilisable pour un screening à grande échelle. Pour toutes ces raisons nous n’avons pas utilisé la méthode de diffusion pour notre test.Bien que la méthode radiorespirométrique (BACTEC®) soit quantitative et permette de déterminer des CMI et même de comparer l’activité des extraits entre eux, la principale limite est son coût élevé et la difficulté de gestion des déchets radioactifs. C’est pour ces raisons que nous ne l’avons pas retenue pour notre travail.
Au nombre des méthodes de dilution, une méthode conventionnelle dite «des proportions» utilisant le milieu de culture LJ a aussi été décrite. Elle n’est pas très adaptée à notre étude, d’une part parce que le délai d’obtention des résultats est long (42 à 56 jours); le long temps d’incubation pourrait être à l’origine de la dégradation de certains produits. De plus, le LJ contient des œufs et il est possible que la quantité de produit à tester disponible soit diminuée suite à une chélation avec l’albumine des œufs. D’autre part, le LJ nécessite un chauffage à 85 °C pendant 45 minutes après incorporation des extraits à tester, ce qui pourrait dégrader les extraits. Lorsqu’on utilise le milieu de culture 7H11 à la place du LJ, on n’a pas besoin d’un chauffage à 85°C, ni d’œufs, mais on a besoin de CO2 et d’un délai d’incubation d’au moins 28 jours. Aussi, M. ulcerans ne pousse pas bien lorsqu’on utilise le MGIT (mycobacteria growth indicator tube). Nous avons alors retenu et utilisé la «Resazurin Microtiter Assay: REMA» pour les tests de sensibilité dans notre étude car elle est simple, rapide (15 jours), financièrement accessible et permet d’éviter le chauffage des extraits. Ceci présente un intérêt pour les composés thermolabiles.
Discussion générale
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8.2.1. Commentaires
- Dans cette étude, nous avons considéré comme inactifs les extraits de plantes dont la CMI est > 250µg/ml. Cette limite se rapproche de celle fixée par Tosun et al qui est de 200 µg/ml pour les extraits bruts (Tosun; 2004). Cette limite de concentration paraît élevée. En effet, Il s’agit ici de produits bruts, donc de mélanges complexes avec des propriétés physico chimiques pouvant agir sur leur solubilité (faible solubilité) ainsi que sur leur interaction avec la paroi de M. ulcerans et son milieu de culture. A titre d’exemple, M. ulcerans, comme toutes les mycobactéries, est moins sensible aux composés polaires du fait de la richesse de sa paroi en lipides (Connell; 1994). C’est pour toutes ces raisons que nous avons choisi une limite de concentration élevée pour les extraits bruts par rapport aux antibiotiques actifs sur M. ulcerans.
- Le taux de plantes actives à faible concentration est de 4.5% (2 plantes sur les 44 testées). Ce taux est faible. Dans cette étude nous avons testé les plantes individuellement; or les tradipraticiens utilisent des remèdes constitués de mélanges de ces plantes. De plus, les conditions de préparation des remèdes ne sont pas superposables aux conditions d’extraction au laboratoire. Pour des raisons de distribution, de disponibilité, de saison, certaines espèces de plantes n’ont pas été récoltées donc non testées. Certaines espèces n’ont pu être testées parce que les solvants utilisés par les tradipraticiens dans leur usage est difficile à reproduire. C’est le cas par exemple de l’usage de l’urine humaine comme solvant de macération de plante.
Pour faciliter la solubilisation des extraits, nous avons utilisé le diméthyl sulfoxide (DMSO) qui n’est pas volatil contrairement aux autres solvants utilisés couramment comme le méthanol et l’éthanol. De plus le DMSO permet une meilleure solubilisation. La REMA a été développée pour la première fois pour M. tuberculosis (Palomino ; 2002) et nous venons de montrer qu’elle est applicable pour tester avec succès les extraits de plantes et de produits naturels sur M. ulcerans. Les drogues végétales testées dans notre étude pourraient avoir en plus une activité inhibitrice sur d’autres bactéries courantes en considérant les propriétés pharmacologiques des grands groupes de composés chimiques qu’elles contiennent. Une telle activité au cas où elle s’avérait, pourrait être mise à profit pour soigner la plaie et prévenir les surinfections. Cela rejoint Addo et al qui dans une étude menée au Ghana en 2008,