Nous avons montré grâce au modèle de cellules HeLa exprimant faiblement les TspanC8s que l’expression de certaines d’entre elles pouvait induire une relocalisation de la protéase ADAM10 du réticulum endoplasmique vers la surface. De plus, en utilisant deux modèles cellulaires exprimant les TspanC8s ainsi qu’ADAM10 (HCT116 et PC3), nous avons montré que l’inhibition de la traduction de la TspanC8 majoritaire de chacune de ces cellules entraînait au contraire une relocalisation d’ADAM10 de la surface cellulaire vers le réticulum. Les données obtenues avec une TspanC8 comme Tspan15 par (Prox et al., 2012) ainsi que nos propres résultats, suggèrent que ces tétraspanines, de par leur capacité à compartimenter la membrane pourraient moduler non seulement l’expression d’ADAM10 à la surface cellulaire mais aussi sa capacité à « rencontrer » ses substrats. La balance entre les niveaux d’expression de différentes TspanC8 pourrait alors être un des paramètres critiques de la capacité d’ADAM10 à interagir et à cliver ses substrats. Dans ce contexte, nous avons voulu savoir ensuite quelle serait la conséquence d’une surexpression de TspanC8s dans un modèle en exprimant déjà de manière endogène. A ce titre, les cellules PC3 constituaient un modèle cellulaire déjà étudié, manipulé et validé au laboratoire au contraire par exemple des cellules HCT116 qui n’étaient utilisées que très ponctuellement. De plus, nous avons vu dans la première partie de ce travail sur les cellules PC3, que l’engagement de tétraspanines telles que CD9 et CD81 (qui ne font pas partie de la sous-famille des TspanC8 et n’affectent pas le trafic d’ADAM10) par des anticorps monoclonaux, conduit à un clivage juxtamembranaire de l’E-cadhérine dépendant d’ADAM10, confirmant ainsi un travail précédent réalisé par Cécile Arduise (Arduise et al., 2008) dans notre laboratoire.
Effets de la surexpression de TspanC8s sur l’expression d’ADAM10 dans les cellules PC3.
Comme nous l’avons montré précédemment (cf. Figure 26), la transfection transitoire des TspanC8s étiquetées avec la GFP dans les cellules PC3 nous a permis d’identifier ADAM10 comme étant un de leurs partenaires primaires communs. De manière
157 analogue aux expériences précédemment réalisées sur les cellules Hela (cf. Figure 31), nous avons dans un premier temps, transfecté transitoirement des cellules PC3 avec les plasmides codant les différentes TspanC8s étiquetées avec la GFP et observé l’expression membranaire d’ADAM10 en fonction de leur surexpression par cytométrie en flux et représentation biparamètrique (Figure 39).
Figure 39 : La surexpression transitoire des TspanC8s Tspan5 et 17 dans les cellules PC3 induit une diminution de la quantité d’ADAM10 détectable à la surface
Les cellules PC3 WT sont transfectées avec des plasmides codant pour différentes TspanC8s ou pour la tétraspanine CD9 couplées à la GFP. 48 heures après la transfection, les cellules sont décollées à la trypsine et sont marquées avec un anticorps dirigé contre ADAM10 et analysées par cytométrie en flux et représentation biparamétrique
Il apparaît clairement ici que contrairement à ce que nous avons pu observer avec les cellules HeLa (cf. Figure 31), les tétraspanines Tspan5 et Tspan17 (les plus fortement apparentées) (Figure 39 gauche) induisent non pas une augmentation mais une diminution de l’expression de surface d’ADAM10. Les autres TspanC8s ainsi que la tétraspanine
158 canonique CD9 (Figure 39 droite) n’ont que très peu (Tspan14) ou pas d’effet. Cependant, nous nous sommes interrogés sur le fait de savoir si cet effet était bien spécifique ou s’il n’était que la conséquence de l’expression transitoire, massive et « toxique » de protéines membranaires affectant le trafic et la sortie du réticulum endoplasmique par saturation des systèmes de transport. Afin de tenter de s’affranchir de ce biais potentiel, nous avons eu recours à l’établissement de lignées stables de cellules PC3 exprimant certaines TspanC8s et avons réalisé la même expérience de cytométrie biparamétrique que précédemment.
Génération de lignées PC3 surexprimant différentes TspanC8 de manière stable et interaction avec ADAM10
Comme le montrent les résultats rapportés sur la figure 40, il ressort que cette analyse sur différentes lignées de cellules PC3 exprimant de manière stable les TspanC8s telles Tspan5, Tspan14, Tspan15 ou Tspan17 ainsi que la tétraspanine CD9 étiquetées GFP confirme les résultats précédents. Ainsi, la surexpression des Tspan5 et 17 entraîne bien une diminution (de l’ordre de 50%) de la quantité d’ADAM10 à la surface des cellules (au contraire des autres TspanC8s) et cette caractéristique ne dépend pas d’un éventuel encombrement de la machinerie de trafic entre les différents organites mise en jeu lors de la synthèse et de l’adressage des protéines puisque la surexpression des différentes TspanC8s testées est ici « stabilisée ». Un effet sur le trafic intracellulaire est ainsi difficile à réconcilier avec le fait que les autres GFP-Tspans qui empruntent au moins initialement les mêmes voies, soient sans effet.
159 Figure 40 : La surexpression stable des TspanC8s Tspan5 et 17 dans les cellules PC3 induit une diminution de la quantité d’ADAM10 détectable à la surface.
Les cellules PC3 WT sont transfectées avec des plasmides codant des TspanC8s ou CD9 couplées à la GFP puis sélectionnées par l’antibiotique G418 et triées selon leur fluorescence GFP la plus élevée. Les cellules sont ensuite décollées à la trypsine et sont marquées avec un anticorps dirigé contre ADAM10 et analysées par cytométrie en flux et représentation biparamétrique.
Nous avons identifié précédemment Tspan5 comme étant le membre de la famille des TspanC8s capable de précipiter ADAM10 de la manière la plus efficace lorsqu’il était transfecté de manière transitoire dans les cellules PC3 (cf. Figure 26). Il s’avère que Tspan5 est une protéine extrêmement conservée parmi les mammifères et de manière plus générale chez les métazoaires (Figure 41). Il est donc plus que probable vu la pression de sélection que cette protéine ait un rôle important dans ces organismes.
160 Figure 41 : Conservation de la tétraspanine Tspan5
A. Comparaison de séquences protéiques d’orthologues de Tspan5. Pour chaque couple, le nombre de différences en acides aminés est représenté en noir et en rouge pour les bases de la séquence codante
B. Exemple de comparaison de séquences protéiques de Tspan5 chez le Cœlacanthe - séquencé dans (Amemiya et al., 2013)- et l’Homme (11 acides aminés substitués et insertion possible mais sujette à caution de 40 acides aminés dans la région de la boucle EC2)
Ainsi, l’extrême conservation de cette protéine (pas de différence entre les séquences humaine et murine et seulement une avec celle chez la tortue par exemple) peut aisément expliquer qu’aucun anticorps n’ait pu être produit jusqu’à présent, en particulier chez la souris. Cette absence de mutation n’est pas la conséquence d’une séquence nucléotidique invariante puisque la comparaison Homme/Souris montre 53 différences à ce niveau. Il est donc très probable que cette extrême conservation au niveau protéique soit le reflet d’un rôle conservé et important chez tous ces organismes. La duplication de gène ayant permis l’émergence de l’ensemble des tétraspanines de la sous-famille TspanC8
161 conduit à des variations de séquences protéiques beaucoup plus importantes pour chacune des TspanC8 « filles » entre ces différents organismes (non montré).
Compte tenu de cet ensemble d’informations, nous avons donc décidé de poursuivre notre étude en nous concentrant spécifiquement sur le rôle possible de l’interaction entre cette tétraspanine et ADAM10 dans le contexte de la régulation fonctionnelle de cette enzyme.
Pour cela, nous avons utilisé quasi-exclusivement des cellules PC3 présentant une expression stable des protéines de fusion GFP-Tspan5 ou GFP-CD9. Brièvement, des cellules PC3 ont été électroporées avec des plasmides codant la protéine de fusion GFP-Tspan5 ainsi qu’un gène de résistance à la néomycine. Après sélection par cet antibiotique durant un mois les cellules sont triées sur le critère de leur fluorescence GFP. Les cellules ayant la plus forte expression de GFP devraient a priori être celles présentant la plus forte expression de la protéine de fusion totale ; elles sont donc conservées et mises en culture.
Il convient ici d’expliquer brièvement les raisons de la stratégie consistant à générer des lignées PC3 présentant une expression stable de la protéine de fusion GFP-Tspan5. Comme je l’ai écrit précédemment, l’extrême conservation de cette protéine n’a pas permis, jusqu’à présent, de générer des anticorps spécifiques. Le seul moyen adéquat de suivre l’expression qualitative et quantitative de Tspan5 était donc d’exprimer cette protéine en l’associant au sein d’une construction de fusion avec l’étiquette fluorescente GFP. Cette GFP est en effet détectable aussi bien directement en raison de sa fluorescence intrinsèque qu’indirectement grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques permettant son immunoprécipitation ou son identification par Western-blot.
Diminution d’ADAM10 membranaire
Spécificité de l’effet de Tspan5 sur l’expression d’ADAM10.
Afin de vérifier que la diminution d’expression d’ADAM10 à la surface cellulaire après surexpression de GFP-Tspan5 n’était pas artéfactuelle et la conséquence de la sélection
162 d’une sous-population particulière de cellules postérieurement au tri, nous avons réalisé une interférence ARN dirigée contre Tspan5. Les cellules ayant subi cette interférence ont ensuite été analysées par cytométrie en flux dans le but d’y quantifier ADAM10 à leur surface. Comme on peut le voir sur la figure 42, l’interférence ARN de Tspan5 est sans effet sur l’expression d’ADAM10 dans les cellules PC3 WT (Figure 42 milieu). Par contre, cette interférence ARN dans les PC3 GFP-Tspan5 conduit à une suppression quasi-totale de l’expression du transgène GFP-Tspan5 et une ré-expression d’ADAM10 à la surface cellulaire (Figure 42 bas). Il apparaît donc clairement que l’effet inhibiteur de l’expression membranaire d’ADAM10 observé dans les cellules PC3-GFP-Tspan5 est parfaitement réversible. Cette réversibilité indique que cet effet n’est pas dû par exemple à un effet d’insertion du transgène dans une région de l’ADN nucléaire particulière entraînant in fine une diminution de l’expression d’ADAM10 qui ne serait pas liée à l’expression/surexpression de la tétraspanine.
163 GFP A D A M 1 0 ADAM10 sur PC3 WT Contrôle sur PC3 WT
ADAM10 sur PC3 WT Si Tspan5 ADAM10 sur PC3 WT Si Contrôle
ADAM10 sur PC3 GFP-Tspan5 Si Tspan5 ADAM10 sur PC3 GFP-Tspan5 Si Contrôle
PC3 WT
PC3 WT
PC3 GFP-Tspan5
Figure 42 : La diminution de la quantité d’ADAM10 à la surface dans des cellules PC3 surexprimant Tspan5 est réversible
Les cellules PC3 WT et PC3 exprimant de manière stable le transgène codant Tspan5 couplée à une étiquette GFP à son extrémité NH2 (GFP-Tspan5) subissent une interférence ARN contrôle (Si Ctrl) ou dirigée contre Tspan5 (Si TSPAN5) pendant 48 heures. Les cellules sont ensuite décollées à la trypsine et sont marquées avec un anticorps dirigé contre ADAM10 et analysées par cytométrie en flux en représentation biparamétrique
L’utilisation d’un seul anticorps monoclonal dirigé contre ADAM10 soulevait la question de savoir si la diminution de la quantité d’ADAM10 membranaire selon le degré de surexpression de GFP-Tspan5 pouvait être due non pas à une diminution réelle de son expression mais à une interférence au niveau de sa détection comme un hypothétique masquage progressif par Tspan5 de l’épitope d’ADAM10 reconnu par l’anticorps monoclonal 11G2. Afin de s’affranchir de ce doute, nous avons effectué une expérience de cytométrie en flux en marquant des cellules surexprimant ou non GFP-Tspan5 par un autre anticorps dirigé contre « l’ectodomaine d’ADAM10 » (mab1427, R&D) (Figure 43). Les résultats sont rigoureusement semblables à ceux obtenus avec l’anticorps monoclonal dirigé contre
164 ADAM10 produit au laboratoire (anticorps 11G2) et montrent donc qu’il est assez improbable, sans pouvoir l’exclure dans ce type d’expérience, que la diminution de la quantité d’ADAM10 membranaire détectable soit due à une altération de la reconnaissance de l’épitope reconnu par les deux anticorps anti-ADAM10. En accord avec l’interprétation de ces résultats par une baisse réelle de l’expression d’ADAM10, une analyse par Western blot montre que c’est la quantité totale d’ADAM10 dans les cellules PC3 et pas seulement le « pool » détectable à la surface qui est très significativement diminué (voir plus loin Figure 53).
Figure 43 : La détection de la diminution d’ADAM10 à la surface n’est pas épitope- dépendante
Les cellules PC3 WT et PC3 GFP-Tspan5 sont décollées à la trypsine et marquées avec un anticorps dirigé contre « l’ectodomaine d’ADAM10 » distinct de celui utilisé en routine et analysées en cytométrie en flux et représentation biparamétrique.
Enfin, ayant jusqu’ici concentré notre attention sur les TspanC8s et la métalloprotéase ADAM10, il convenait de vérifier si la surexpression de Tspan5 entraînait une diminution globale de l’expression des protéines de surface ou si ce phénomène était spécifique du partenaire direct identifié de Tspan5, ADAM10. Pour cela, nous avons testé par
165 cytométrie en flux, l’expression membranaire de différentes protéines à la surface des cellules PC3 GFP-Tspan5 (Figure 44). Il s’avère que parmi les protéines testées, regroupant des tétraspanines (CD9 et CD81), des partenaires de tétraspanines (CD9-P1 et Int-β1), une protéine membranaire retrouvée dans les rafts (CD55), l’ADAM la plus proche d’ADAM10, ADAM17 ainsi que des récepteurs comme EphA2 et l’EGFR (l’appartenance de ce dernier au réseau de tétraspanine est possible puisqu’il a été montré coimmunoprécipité avec CD82 en tampon de lyse contenant le détergent Brij98 (Odintsova et al., 2000)-. Les résultats rapportés sur la figure 44, indiquent clairement qu’aucune de ces protéines membranaires ne voit son expression à la surface des cellules altérée. Ainsi, parmi l’ensemble des protéines de surface testées seule l’expression membranaire d’ADAM10 est notablement altérée par une surexpression de GFP-Tspan5.
Figure 44 : La surexpression de Tspan5 n’affecte pas l’expression membranaire d’autres protéines de surface.
Les cellules PC3 GFP-Tspan5 sont décollées à la trypsine et marquées avec des anticorps dirigés contre des tétraspanines (CD9, CD81), des partenaires de tétraspanines (CD9-P1, Intégrine β1), une protéine de raft (CD55), d’autres protéines de surface (EGFR, EphA2,
166 ADAM17). Les cellules sont analysées par cytométrie en flux et représentation biparamétrique
Stabilité d’expression du transgène GFP-Tspan5
Perte d’expression de Tspan5
Nous nous sommes rapidement aperçus que le transgène codant GFP-Tspan5 supposément stabilisé au sein des cellules PC3 semblait avoir une expression instable et conduisant à une perte presque totale d’expression au fil du temps.. Plus le nombre de repiquages était important, moins il y avait de cellules exprimant la GFP comme nous le contrôlions par cytométrie en flux. De plus, les cellules exprimant toujours la GFP après une douzaine de passages ne l’exprimaient plus avec une intensité aussi forte que lors des premiers passages en culture (non montré). Une partie de ce phénomène semble être lié à l’état de confluence des cellules puisque la diminution de l’expression de GFP-Tspan5 est corrélée avec l’augmentation du nombre de cellules (donc à leur densité) (Figure 45).
Figure 45 : L’expression du transgène GFP-Tspan5 décroît lorsque la confluence cellulaire augmente.
167 Les cellules PC3 GFP-Tspan5 croissent en milieu complet et on contrôle leur croissance par comptage des cellules ainsi que l’expression du transgène GFP-Tspan5 en cytométrie en flux au cours du temps.
En faveur de cette hypothèse, nous avons pu observer que dans les 48 heures après un « repiquage », la proportion de cellules exprimant la GFP pouvait quelquefois diminuer de moitié en une quinzaine d’heures jusqu’à atteindre 10-15% du nombre total. Puis après plusieurs repiquages et ré-étalements, cette proportion pouvait remonter à plus de 60%. La confluence cellulaire ne semble pas être le seul paramètre mis en jeu puisque nous avons pu observer une baisse constante de l’expression du transgène avec le nombre de « repiquages » même en ayant soin d’empêcher les cellules d’atteindre cette confluence entre deux « repiquage » (Figure 46).
Figure 46 : L’expression du transgène GFP-Tspan5 décroît lorsque le nombre de repiquages augmente
Les cellules PC3 GFP-Tspan5 croissent en milieu complet et sont repiquées au 1/5 toutes les 48 heures. On contrôle l’expression du transgène en cytométrie en flux au cours du temps.
168 Nous avons émis l’hypothèse que le tri cellulaire n’ayant pas abouti à une population totalement homogène et positive en terme d’expression du transgène, les cellules exprimant le moins le transgène GFP Tspan5 aurait pu se multiplier plus vite et aux dépends des autres. Nous avons testé cette hypothèse en clonant un certain nombre de cellules par dilution limite. Après clonage et expansion des clones, tous apparaissent hétérogènes en terme d’expression de GFP-Tspan5 et une même perte de fluorescence GFP est observée après quelques jours de culture quelque soit le niveau d’expression de GFP-Tspan5 du clone de départ (Figure 47). Ce résultat est clairement défavorable à notre hypothèse de départ.
Figure 47 : L’ensemble de la population PC3 GFP-Tspan5 voit l’expression du transgène GFP-Tspan5 décroître avec la durée de culture
Des cultures clonales (1-5) de PC3 GFP-Tspan5 sont générées par dilution limite de la population initiale. Après expansion, les clones sont repiqués dans un flacon à la surface assez importante pour permettre une prolifération sur une semaine entière et l’expression du transgène GFP-Tspan5 est contrôlée par cytométrie en flux au cours du temps en culture.
169 Il ne s’agit pas d’un effet dû au site d’insertion du transgène et à la sélection d’une population faussement polyclonale puisque ce même phénomène s’est reproduit avec une autre population polyclonale « stable » de cellules PC3-GFP-Tspan5 indépendante de celle-ci. De plus, l’expression stable de ce même transgène dans des cellules HEK entraîne une régulation négative de son expression bien moins efficace que dans le contexte des cellules PC3. Cet effet semble donc être dû à la combinaison d’un type cellulaire et d’un transgène particulier et ne pourrait donc probablement pas être solutionné par une technique de transfection virale. Il semble que la cellule PC3 régule l’expression du transgène sans toutefois l’expulser totalement ce qui favorise l’idée d’un rôle important mais non toxique à faible niveau d’expression pour Tspan5.
Le plasmide (pcDNA3) utilisé pour les transfections et expressions des différents transgènes porte un gène de sélection, le gène de la résistance à la néomycine, sous la dépendance du promoteur SV40. Le transgène proprement dit est sous la dépendance du promoteur CMV. Il apparaît que les cellules présentant une diminution de la fluorescence sont toujours résistantes à l’action de la néomycine. D’autre part il a été décrit que le promoteur CMV pouvait, sous certaines conditions être « éteint ». Une extinction du promoteur CMV pourrait donc expliquer la perte d’expression du transgène dans les cellules transfectées, parallèlement à une conservation de la résistance à la néomycine portée par le plasmide.
Epigénétique et Tspan5
Il n’est pas rare que les transgènes soient sujets à une forte régulation de la part de la machinerie cellulaire. Un exemple parmi tant d’autres est le cas de la reconnaissance et la suppression de certains plasmides ayant un promoteur p21 (ou quelques autres testés) par la protéine ZNF511-PRAP1 dont l’expression est induite par la transfection. De manière très intéressante d’un point de vue évolutif, ZNF511-PRAP1, protéine jouant un rôle hypothétique dans l’homéostasie de croissance (Zhang et al., 2003), ne se lie qu’aux promoteurs transgéniques et non aux promoteurs endogènes et empêche la transcription de ces transgènes par régulation de la déacétylation des histones. Ce mécanisme permet donc
170 une protection contre l’envahissement du génome par les ADN étrangers et est d’autant plus important dans les cellules épithéliales en interaction avec l’environnement (Qiu et al., 2011).
Les octamères d’histones peuvent subir des modifications post traductionnelles dont l’acétylation -pour revue « historique », (Strahl & Allis, 2000)-. L’association histone-ADN est facilitée par des charges négatives des acides aminés lysine et arginine localisés au niveau de queues N-terminales des monomères constituant l’histone. L’acétylation de ces résidus par les histones acétyltransférase va apporter des charges positives au niveau de ces « queues » N-terminales et diminuer l’affinité de l’histone pour l’ADN. L’association ADN- histone est alors moins intime et la machinerie transcriptionnelle va pouvoir être mise en route. La déacetylation est catalysée par des histones déacetylases.