Etude de l’effet protecteur des extraits polaires dé-sucrés vis-à-vis d’un stress

3.2.3.1 Activité anti-oxydante cellulaire (CAA)

L’activité anti-oxydante cellulaire est évaluée au moyen d’une méthode adaptée au test CAA développé par Wolfe et al (2007). Cet essai se base sur l’utilisation d’une sonde, la 2’,7’-dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) capable d’être internalisée pas les cellules (Figure 3-6). Sous l’action des estérases cellulaires, qui vont cliver la fonction di-acétate, celle-ci se retrouve alors piégée dans le compartiment cellulaire sous forme de DCFH. Enfin, les espèces radicalaires vont pouvoir dégrader cette DCFH générant la DCF fluorescente à 538 nm lorsqu’excitée à 485 nm. Une augmentation de la fluorescence par rapport à un contrôle va donc traduire la présence de radicaux libres et donc un stress oxydant. Le pouvoir antioxydant des extraits est ainsi évalué en pré-incubant les cellules avec à la fois la sonde et l’extrait étudié, avant d’induire un état de stress oxydant par l’insuline.

Figure 3-6 : Principe de la méthode de mesure de la capacité anti-oxydante cellulaire

(Adapté de Wolfe et al 2007)

Les cellules sont ensemencées à 100 000 cellules/puits dans 200 µL de milieu complet en plaque de 96 puits, puis cultivés pendant 48 h. Le surnageant est ensuite éliminé et

96 remplacé par le milieu (-) contenant 60 µmol/L de DCFH-DA ainsi qu’une concentration donnée d’EPDS (10 ; 20 ; 50 ; 80 ; 150 ; 200 ; 300 µg/mL). Les cellules sont cultivés pendant 24 h, puis les puits sont rincés 2 fois par 200 µL de Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (Lonza, Verviers, Belgique), avant l’induction du stress oxydant par ajout de 100 µL d’Umuline NPH (Lilly, France) à 25 UI/mL dans du milieu (-). Immédiatement après induction du stress oxydant, une cinétique de fluorescence est réalisée (Ex : 485 nm ; Em 538 nm) avec une mesure toutes les 5 minutes pendant 100 minutes. L’activité anti-oxydante cellulaire pour chaque concentration est calculée en intégrant l’aire sous la courbe cinétique, selon l’équation suivante :

Le blanc représente le contrôle négatif, c’est-à-dire des cellules incubées avec la DCFH-DA mais qui ne subissent aucun stress oxydant induit. Le contrôle correspond aux cellules incubées avec la DCFH-DA, soumis ensuite au stress oxydant induit.

3.2.3.2 Observations microscopiques

3.2.3.2.1 Les ROS au niveau cellulaire – DHE

La dihydroéthidine (DHE) (Sigma) est un agent chimique permettant la mise en évidence de ROS dans les cellules. Cette molécule est capable d’entrer dans les cellules, et en présence de ROS, elle sera transformée en éthidium qui a la particularité d’être fluorescent et de s’intercaler à l’ADN. Ceci peut être révélé par l’observation de l’émission à 610 nm au microscope à fluorescence suite à l’excitation à 488 nm.

Les cellules RINm5F sont ensemencées à 1.10⁶ cellules/puits dans le milieu complet en plaque 6 puits, et sont cultivés pendant 48 h. Le surnageant est ensuite éliminé, et un milieu (-) contenant 20, 50 ou 80 µg d’EPDS de cerise (var. Regina)/mL est ajouté à raison de 1 mL/puits. Les cellules sont alors incubées pendant 1 h à 37 °C, puis les puits sont rincés au HBSS avant induction d’un stress oxydant par ajout de 1 mL/puits de HBSS contenant 50 µmol/L de peroxyde d’hydrogène. Les cellules sont encore incubées pendant 1 h, puis les puits sont rincés avec de l’HBSS avant l’ajout de 1 mL/puits de DHE à 2,5.10-6

mol/L. Après une dernière incubation de 30 minutes, le surnageant est éliminé, les puits sont rincés au HBSS, puis les observations de la fluorescence à 610 nm sont réalisées au microscope avec

97 une excitation à 488 nm et une immersion x 40 (NIS-Element BR, Nikon, France). 4 à 5 plages sont observées par puits, afin de pouvoir déterminer le niveau moyen de fluorescence par puits, et donc d’évaluer le niveau de ROS dans chaque condition testée.

3.2.3.2.2 Observation du potentiel protecteur des EPDS vis-à-vis d’un stress oxydant induit par un hyperinsulinisme in vitro (DCFH-DA)

Les cellules RINm5F sont ensemencées à 2.10⁶cellules/puits dans le milieu complet en plaque de 6 puits, puis cultivées pendant 48 h. Suit alors une pré-incubation de 24 h avec les extraits (à 50 ou 300 µg/mL) dans le milieu (-) contenant 60 µmol/L de DCFH-DA. Les puits sont ensuite rincés 3 fois par 2 mL de HBSS, avant induction du stress insulinique par ajout de 1 mL d’Umuline NPH à 25 UI/mL dans le milieu (-), et incubation pendant 100 minutes. Les puits sont enfin rincés 3 fois par 2 mL de HBSS. Les observations en microscopie à fluorescence (NIS-Element BR, Nikon, France) sont réalisées dans les conditions suivantes : longueur d’onde d’excitation de 485 nm ; longueur d’onde d’émission de 538 nm ; immersion x 40. Afin d’évaluer le potentiel préventif des traitements des cellules par pré-incubation avec les extraits de F&L, chaque puits est observé sur 5 plages différentes permettant ensuite de mesurer le niveau de fluorescence moyen. Ce niveau de fluorescence est alors comparé aux conditions « contrôle » et « stress insulinique sans pré-traitement ».

3.2.3.3 Effets des extraits sur l’expression des enzymes endogènes anti- et pro-oxydantes

Afin d’évaluer l’effet des EPDS de cerise, de carotte et de chou rouge vis-à-vis de l’expression des enzymes impliqués dans la balance oxydative sur le modèle cellulaire des RINm5f, nous avons procédé à un dosage de plusieurs enzymes par la technique de western blot.

Les cellules RINm5f sont ensemencées en plaque de 6 puits à raison de 2.10⁶ cellules/puits, puis incubées pendant 48 h à 37 °C.

- Les traitements consistent en l’incubation des cellules à 1 mL/puits avec du milieu sans SVF contenant 50 ; 150 ou 300 µg/mL d’EPDS de cerise (var. Régina), de chou rouge ou de carotte.

- Le stress insulinique est induit par l’incubation des cellules à 100µL/mL avec du milieu sans SVF contenant 25 UI/mL d’Umuline NPH.

98 Les conditions suivantes ont été testées :

- CTL : aucun traitement ni stress induit - Traitement seul 24 h

- Stress seul 24 h

- Traitement 24 h puis stress 24 h - Stress 24 h puis traitement 24 h

Les extractions de protéines sont réalisées grâce au tampon de lyse Tris Ultra Pure (Euromedex, Souffelweyersheim, France), consistant en 137 mmol/L de NaCl (Merck, France), 1% Igepal (Sigma), 31 mmol/L de PMSF (Eurobio, Les Ulis, France), 10% glycérol (Sigma), et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (Roche Diagnostics, Meylan, France). Le lysat est récupéré, incubé 30 min dans la glace en vortexant toutes les 10 minutes, puis il est centrifugé à 10 000 g pendant 10 minutes. Les protéines sont ensuite dosées par la méthode de bradford. Puis 10 µg de protéines sont déposées et séparées sur un gel 4-12% Bis-Tris CriterionTM XT Precast (Bio-Rad, Marne-La-Coquette, France) et enfin transférées sur membrane Immobilon PVDF (Millipore, Molsheim, France). Les membranes sont alors bloquées à température ambiante pendant 2 h grâce à un tampon bloquant contenant 5% de poudre de lait dégraissé afin de prévenir la fixation non-spécifique. Les membranes sont ensuite incubées avec les anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit.

Les anticorps primaires utilisés sont les suivants :

Anti-MnSOD (1/500) et anti-Catalase (1/500) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) Anti-GADPH (1/500), Anti-p22phox (NADPH Oxydase) (1/500).

Enfin, les membranes sont incubées avec un anticorps secondaire couplé à la protéine HRP (Horseradish peroxidase). La quantification relative des protéines est réalisée par comparaison avec la β-actine, protéine de référence, grâce au logiciel Image J.