Chapitre 4:Résultats et Discussion
IV. Etude de l’activité anti-bactérienne
La production des substances antibactériennes par les souches de moisissures est mise en évidence par la technique des cylindres d’Agar.
Le test d’activité antibactérienne des isolats a révélé que dix isolats présentent une activité antibactérienne sur, au moins, une des bactéries tests (Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus cereus). Après incubation, la présence des zones d’inhibition indique 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% P ou rc en tage d 'i sol at s fon gi q u es (%) Les souches Pourcentage
un résultat positif. Cette zone a été observée autour des disques de moisissures ce qui signifie que ces isolats fongiques produisent des molécules antibactériennes capables de stopper la croissance des bactéries tests (Figure 21).
Les isolats fongiques peuvent être divisés en 3 groupes en fonction de diamètre de la zone d’inhibition qui varie entre 0.6 à 1.5 cm : Des isolats à fort, à moyen et à faible effet antibactérien (Annexe 5).
• Sur Escherichia coli (Gram-)
Figure 22: La variation de la zone d’inhibition entre différentes souches et E.coli.
Parmi les 20 espèces de moisissures testées, seulement quatre ont montré un effet antibactérien vis-à-vis d’ Escherichia coli (Gram-), à savoir : l’espèce à fort effet anti bactérien Penicillium sp3, avec une zone de lyse égale à 1,5 cm. Geotricum sp1, Absidia sp sont considérés comme des espèces à moyen effet antibactérien, avec une zone de lyse égale à 1 cm et 0,8 cm. Alors que Fusarium sp3 à un faible effet anti bactérien avec une zone d’inhibition égale à 0,6 cm. 0 0,5 1 1,5 D iam è tr e d 'i n h ib it ion Les souches Diamètre d’inhibition
•Sur Pseudomonas aeruginosa (Gram-)
Figure 23 : Variation de la zone d’inhibition en fonction des espèces de moisissures isolées
contre P.aeruginosa.
Les espèces Penicillium sp1, Geotricum sp1, Absidia sp, Alternaria sp2 et Geotricum sp2 ont donné un moyen effet antibactérien vis-à-vis P.aeruginosa avec une zone de lyse
égale à 0,9 cm ; 1 cm ; 1 cm ; 0,8 cm et 0,8 cm en ordre.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
D iam è tr e d 'i n h ib it ionLes souches
Diamètre d’inhibition•Sur Bacillus cereus(Gram+)
Figure 24 : La variation de la zone d’inhibition entre des différentes souches et B.cereus
7/20 espèces de moisissures appartenant à 4 genres : Fusarium, Penicillium, Geotricum et Absidiam ont montrent une activité antibactérienne significative, contre B.cereus à savoir les espèces à fort effet antibactérien : Penicillium sp1, Geotricum sp1 et Fusarium sp2 avec une zone d’inhibition égale à 1,2 cm ; 1,3 cm et 1,2 cm en ordre. Fusarium sp1, Penicillium sp et Geotricum sp2, représentent les isolats à effet antibactérien
moyen avec une zone d’inhibition entre 0,8 à 1 cm respectivement. Absidia sp a donné un faible effet antibactérien contre B.cereus avec une zone de lyse égale à 0,6 cm.
L’histoire des antibiotiques a commencé en 1877, Pasteur et Joubert observent qu’une bactérie se développe moins dans un bouillon envahi de moisissures. Cette remarque entraine progressivement l’utilisation des moisissures pour lutter contre les infections microbiennes (Moroh, 2013). En 1897, Ernest Duchesne, médecin militaire français indique dans sa thèse intitulé « contribution à l’étude de la concurrence vitale chez les micro-organismes » l’existence d’un antagonisme entre les moisissures (Penicillium glaucum) et les bactéries (Brezinski, 2006). En effet, selon Botton et al., (1990), les espèces de moisissures sont connues par leur production de substances à effet antibactérien, elles produisent, généralement, des métabolites secondaires biologiquement actifs, synthétisés en fin de
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 D iam èt re d 'i n h ib it ion Les souches Diamètre d’inhibition
croissance et possèdent des structures chimiques différentes de celles des protéines. Il est connu que ces genres constituent le réservoir principal de substances anti bactériennes. Les champignons filamenteux sont des grands producteurs d’antibiotiques tel que la pénicilline produite par le genre Penicillium et la céphalosporine produite par Cephalosporium (Larpend- Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Botton et al., 1999).
Nos résultats diffère a ceux obtenus par Benghrieb et Gerboua en 2017 qui malgré la même souche de Pénicillium sp isolé à partir du même endroit de Sebkha Ezzemoul Ain-mlila testée sur les mêmes bactéries test (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) donne des résultats différents .dans leurs travaux ils ont trouvé un effet antibactérien de Pénicillium sp vis-à-vis de deux bactéries Gram (-) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Alors que nos résultats montrent qu’il n’ya aucun effet antibactérien vis-à-vis de deux bactéries Gram (-). Même remarque sur les travaux de Abdelaziz en 2006 dans son mémoire intitulé « Isolement des mycètes producteurs de substances antibactériennes à partir des sols sahariens » là que les souches : Aspergillus niger, Aspergillus sp1,cladosporuim sp, Fusarium sp1, Fusarium sp3,
Pénicillium sp1, Penicillium sp2, Alternaria sp possèdent des effet antibactérien vis-à-vis sur Escherichia coli , mais même ces souches sur même bactérie ne donne aucune effet
antibactérien dans nos résultats. Tout cela permet de confirmer que la différence des espèces du même genre et la différence dans la nature des sols (sols salins, sols sahariens) rendre chacune de moisissures possèdent des propriétés déférentes par rapport à l’autre.
V. Etude de l’activité enzymatique
V.1. Détermination de l'activité protéolytique
Les enzymes protéolytiques sont des hydrolases formées d’une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques. Les protéases catalysent le clivage des liaisons peptidiques de toute molécule protéique, elles scindent les protéines en fragments polypeptidiques, qui seront par la suite transformés sous l’influence des peptidases en leurs sous-unités constitutives, les acides aminés, offrant une multitude de structures (Frazier, 1967 ; Scriban, 1999).
L’observation d’une zone claire autour de la colonie microbienne prouve la production de protéase (Colwell et Grigorova, 1989 ; Richard, 2005).
Les résultats obtenus après incubation sur gélose caséinée ont permis la sélection de quatre souches ayant une activité protéolytique parmi les dix souches testées (annexe 7). Les souches protéolytiques sont reconnues par l’halo transparent résultant de la dégradation de la gélose
caséinée par l’exoprotéase produite et qui entoure les colonies (figure 25) ; plus le halo est grand, plus la quantité d’enzyme est importante.
Deux souches (S1, S11) sont caractérisées par des zone d’hydrolyse faibles (≤ 1,5cm).Alors que les deux autres souches (S12, S16) ayant des zones d’hydrolyse plus importantes (>1,5cm).
Figure 25 : Résultat de la croissance des souches protéolytique sur gélose au lait.
Les protéases constituent les enzymes les plus importantes qui peuvent être produites par plusieurs genres fongiques tels que Penicillium, Trichoderma, Mucor, Rhizopus,
Fusarium, Rhizomucor, Endothia, etc (Frazier, 1967 ; Ul-haq et al., 2003).
Ces résultats permettent de considérer ces souches comme des moisissures productrices de protéases exocellulaires (Smith et al., 1952).
Conclusion
et Perspectives
Conclusion et Perspectives
L’objectif principal de ce mémoire est la recherche de l’activité antibactérienne élaborée par les moisissures halophiles isolées du sol de la rhizosphère de plantes adjacentes de Sebkha Ezzmoul d’Ain-mlila vis-à-vis de trois souches bactériennes ; une à coloration Gram+ (Bacillus cereus ATCC10987) et deux à coloration Gram- (Escherichia coli ATCC11303, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853).En effet, l’isolement des microorganismes halophiles a été réalisé dans les différentes concentrations (1,5% ,5%, 10%) de Na Cl.
Les cultures des prélèvements sur PDA ont permis l’isolement du vingt moisissures différentes. Le pouvoir inhibiteur de la Ampiline au cours de l’isolement ont permis de réduire l’apparition des bactéries. Parmi les vingt espèces de moisissures, dix ont montré un effet antibactérien contre les bactéries testées.
Pour l’identification des moisissures halophiles isolées, une étude macroscopique est effectuée. Cette dernière a permis de déterminer les caractéristiques morphologiques telles que la couleur, texture, topographie et vitesse de croissance. Cette étape est complétée par une étude microscopique permis d’identifier les genres : 6 Penicillium, 3 Fusarium, 3Alternaria,
2Aspergillus, 2 Geotricum , 2 Cladosporium , 1 Ulocladium , 1 Absidia sp.
Dans le cadre de la recherche des enzymes protéolytiques élaborées par des moisissures halophiles sur gélose caséinée, quatre souches possèdent l’activité protéolytique.
Tous ces résultats montrent la richesse de nos milieux extrêmes en moisissures et les possibilités offertes pour la recherche de nouvelles espèces hyperproductrices d’enzymes ayant un intérêt industriel.
Nous comptons dans l’avenir optimiser les paramètres de culture des souches afin d’améliorer leur production de biomolécules à potentiel biotechnologique important.
Une piste très intéressante à suivre serait la recherche de la production des souches de substances antibactériennes (antibiotiques) sur ce cadre de recherche une étude est en cours, et ce modeste travail de caractérisations phénotypiques constitue un début d’investigation.
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