TABLE DES ABREVIATIONS
3. Etude clinique pilote
L’étude du stress oxydant au cours du diabète de type 2 a fait l’objet de nombreux travaux chez l’animal mais peu de données sont disponibles chez l’homme. Or, le stress oxydant est un déterminant majeur de l’installation du diabète de type 2. L’excès des ROS est à l’origine de la perturbation du métabolisme énergétique musculaire et ce phénomène est réversible après supplémentation en antioxydants.
En effet les travaux de Bonnard, Rieusset et al. ont montré sur des modèles de souris rendues diabétiques que des dysfonctionnement mitochondriaux semblent être la conséquence d’un stress oxydant musculaire associé à l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie (Bonnard C et al, 2008). Les chercheurs ont dans un premier temps montré que les altérations mitochondriales n’étaient pas un évènement précoce dans la survenue d’un diabète de type 2 puisqu’une diète de 4 semaines riche en lipides et en sucrose, suffisante pour induire une intolérance au glucose, ne produisait aucune altération mitochondriale dans le muscle squelettique des souris. Par contre, après 16 semaines de ce régime, les souris rendues diabétiques présentaient bien une altération de la biogénèse, de la structure et des fonctions mitochondriales. L’équipe a de plus observé l’augmentation de la production des ROS dans le muscle des souris diabétiques. Afin de confirmer l’implication des ROS dans les altérations mitochondriales en situation de diabète, les auteurs ont utilisé un autre modèle murin, la souris traitée à la streptozocine, qui présente un fort stress oxydant associé à une hyperglycémie, mais pas d’obésité ni d’insulinorésistance. Dans ce modèle, la production des ROS musculaire était également associée à des altérations mitochondriales, ces dernières pouvant être prévenues soit par un traitement à l’insuline, soit par un traitement antioxydant. Ces données confirment l’absence de relation directe entre altérations mitochondriales et insulinorésistance, et démontrent l’implication des ROS dans les altérations mitochondriales (Bonnard C et al, 2008). Enfin, l’induction in vitro de ROS par le glucose ou des lipides altère la densité et les fonctions mitochondriales dans des cellules musculaires en culture, et ces effets sont restaurés par un traitement antioxydant (Bonnard C et al, 2008).
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L’ensemble de ces données suggère donc que les altérations mitochondriales sont la conséquence d’un stress oxydant musculaire associé à l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie des souris diabétiques.
Une autre étude, réalisée sur des cellules endothéliales d’origine humaine, montre que des concentrations élevées en glucose augmentent les activités des enzymes anti-oxydantes (SOD à Cu, Zn, catalase) ainsi que l’expression des ARNm de ces enzymes. Selon les auteurs de cette étude, la surexpression cellulaire de ces enzymes anti-oxydantes constitue une réponse au stress oxydant consécutif à une glycémie élevée (Ceriello A, et al, 1996).
L’objectif de ce travail est de rechercher une relation directe entre hyperglycémie et stress oxydant chez des patients diabétiques de type 2 ainsi qu’une baisse de ce stress par la prise en charge du diabète à l’hôpital.
L’évaluation du stress oxydant est réalisée par le dosage urinaire du 8-Isoprostane.
3.1. Matériels et méthodes 3.1.1. Patients
Cette étude a été réalisée chez 26 patients diabétiques de type 2 hospitalisés au CHU de Rouen en service diabétologie. Cette population était constituée de 9 femmes âgées de 46 à 78 ans et de 17 hommes âgés de 49 à 79 ans. Pour être inclus dans l’étude, les patients devaient présenter un diabète décompensé : hyperglycémies répétées et/ou supérieures à 2g/L, une hémoglobine glyquée élevée (7,7-13,4%, moyenne : 10,6%). L’hospitalisation devait durer au minimum 5 jours consécutifs. Lors de l’hospitalisation, les patients ont bénéficié d’un ajustement de leur traitement antidiabétique ainsi que la mise en place de règles hygiéno- diététiques. Dans cette étude, nous avons exclus les patients ayant des complications cardiaques, infectieuses, oculaires récentes, les patients ayant un syndrome inflammatoire sévère, les patients non diabétiques de type 2.
L’étude a été effectuée après que chaque patient ait donné par écrit son consentement éclairé, en accord avec les directives européennes qui n’exigent pas d’autorisation d’un comité d’éthique pour le type de plan expérimental utilisé ici (Annexe 1 : formulaire de non opposition aux recueils des échantillons urinaires). De plus pendant leur hospitalisation, une fiche de renseignements (Annexe 2) a été complétée, celle-ci regroupe les principales données biologiques et cliniques nécessaires pour l’étude.
3.1.2. Méthodes
Les glycémies à jeun et post-prandiales ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de glycémie portatif par la méthode de la glucokinase. La glycémie postprandiale était effectuée 1h30 après le repas.
Un prélèvement de sang sur tube EDTA est réalisé pour les dosages suivants : HbA1c, cholestérol, cholestérol HDL, triglycérides, CRP et formule
sanguine. Une pesée et un calcul de l’IMC ont aussi été faits à l’entrée et à la sortie des patients. L’analyse de l’HbA1c est réalisée par chromatographie liquide haute
performance. Le dosage du cholestérol total se fait par la méthode de la cholestérol oxydase de même que le dosage du cholestérol HDL et des triglycérides qui s’effectue aussi par méthode enzymatique (COBAS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim (Allemagne)).
Deux échantillons urinaires ont été recueillis, le premier à J0 et le second le jour de la sortie, puis conservés à -80°C en présen ce d’un antioxydant (BHT) jusqu’à la réalisation des dosages des 8-iso PGF2 et des créatinines urinaires. La créatinine
urinaire est évaluée par méthode cinétique de Jaffé. La concentration en CRP est déterminée par immunodosage (BNII, Beckman Coulter, Lasadena, USA). La clairance à la créatinine est calculée par la formule MDRD. Les pressions artérielles diastoliques et systoliques sont mesurées au bras droit après 5 minutes de repos en position de décubitus dorsal. Le calcul de l’IMC se fait à partir du poids et de la taille notée.
Le 8-iso PGF2 (8-IP) est l’isoprostane qui est choisi comme reflet du niveau de
stress oxydant du sujet. Son dosage se fait après recueil des échantillons urinaires par une méthode immunoenzymatique (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA) mise en œuvre sur 2 jours. Cayman’s 8-Isoprostane EIA Kit est une technique qui peut être utilisée pour quantifier le 8-IP dans le plasma, les urines et d’autres liquides biologiques. Après la phase de purification et d’évaporation, chaque échantillon urinaire est repris dans le tampon EIA du kit. Les dosages sont réalisés de façon semi-automatisée à l’aide de l’automate ETI-MAX 3000 (Diasorin, Saluggia, Italie). Tous les aliquotes sont placés dans l’ETI-MAX ainsi que tous les réactifs nécessaire et la plaque à 96 puits. Cette méthode est basée sur la compétition entre les 8-IP libres et les 8-IP couplés à l’acétylcholinestérase (8-isprostane traceur) pour se lier à l’antisérum spécifique des 8-IP. Parce que la concentration du 8-IP traceur est maintenue constante tandis que la concentration du 8-IP libre varie, la quantité
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de 8-IP traceur capable de se lier à l’antisérum est inversement proportionnelle à la concentration de 8-isoprostanes dans les puits. L’ensemble 8-isoprostanes- antisérum se fixe sur des anticorps monoclonaux positionnés au fond des puits. Après 18 heures d’incubation, la plaque est lavée pour éliminer l’excès de réactifs et le réactif d’Ellman est alors ajouté dans les puits. L’intensité de la coloration, déterminée par spectrophotomètre, est proportionnelle à la quantité de traceur et donc inversement proportionnelle à la quantité de 8-isoprostanes libres dans les puits. Le réactif d’Ellman contient de l’acétylthiocholine qui, sous l’action de la cholinestérase, fournit deux produits dont l’acide 5-thio-2-nitrobenzoïque dont l’absorbance à 412nm est mesurée.
Les dosages ont été réalisés au Laboratoire de Biochimie Médicale du CHU. Le premier jour, ce fut l’étape de purification et d’extraction des échantillons urinaires. La purification est réalisée sur des colonnes avec un tampon d’affinité pour le 8- isoprostane. Nous disposions de douze colonnes que l’on a régénérées deux fois pour purifier 40 échantillons. Cette étape terminée, il s’ensuit une phase d’évaporation sous azote pendant 3h. Le reste de la manipulation est réalisée sur l’ETI-MAX 3000. Nous préparons les réactifs et disposons tout le matériel dans l’appareil pour son bon fonctionnement. L’ETI-MAX réalise les différents transferts d’échantillons et de réactifs au sein de la plaque 96 puits pour mettre en œuvre la méthode. Avant la prochaine étape, 18h d’incubation sont nécessaires. Le lendemain a lieu l’ajout du réactif d’Ellman, puis la lecture par spectrophotométrie de la plaque. Les résultats ont été exprimés en concentrations absolues et rapportés à la créatininurie (ng/mmol créatinine).
Les tests statistiques non-paramétriques de Wilcoxon pour séries appariées (variation des marqueurs entre l’admission et la sortie) et de corrélation de Spearman (corrélation 8-IP/glycémies) ont été utilisés.
3.2. Résultats et discussion
Les caractéristiques cliniques et biologiques des 26 patients sont indiquées dans les tableaux 6 et 7.
Tableau 6 : Données cliniques Patients Age Pression artérielle Systolique/diastolique à l’entrée (mmHg) Poids à l’entrée (Kg) Poids à la sortie (Kg) IMC à l’entrée (Kg/m²) N : 18,5-25 IMC à la sortie (Kg/m²) N : 18,5-25 1 78 16/8 108 103 41 39 2 49 ND 106 104 36 ND 3 65 14/7 75 74 26 26 4 74 13/9 89 90 31 31 5 51 ND 104 101 36 35 6 73 19/10 78 78 25 26 7 48 15/7 74 73 27 26 8 71 12/8 78 78 31 31 9 53 13/7 78 76 29 28 10 60 15/8 74 73 29 29 11 64 11/8 109 105 38 36 12 49 15/9 114 113 37 37 13 46 13/8 136 134 46 45 14 55 16/11 133 130 43 42 15 52 10/6 109 108 34 34 16 57 13/8 71 74 25 26 17 58 14/6 92 91 38 38 18 53 13/8 103 101 43 42 19 71 11/7 95 94 35 35 20 72 12/7 66 ND 25 ND 21 67 12/7 76 75 26 26 22 66 14/7 64 64 27 27 23 52 17/9 125 ND 44 ND 24 58 13/7 95 93 36 35 25 55 14/8 115 ND 37 ND 26 79 18/9 98 ND 37 ND
93 Tableau 7 : Données biologiques
Patients Glycémie à l’entrée (g/L) N : 0,7-1,1 Hb1Ac à l’entrée (%) N : 4,5- 6,0 CRP à l’entrée (mg/L) N : <5 GB à l’entrée (g/L) N : 4-10 Clairance à la créatinine à l’entrée (mL/mn) N : 80-100 1 1,29 10,7 60 9,9 ND 2 1,22 13,4 6 9,4 250 3 1,62 9,6 <5 6,5 90 4 1,76 9,1 8 5,2 15 5 1,47 8,3 <5 4,9 ND 6 1,73 9,3 <5 7,6 50 7 3,84 11,6 <5 8,9 ND 8 2,95 10,9 <5 4,9 125 9 1,37 8,8 <5 6,5 96 10 2,56 10,8 <5 6,4 160 11 2,67 10,3 <5 7,9 42 12 2,1 10,6 <5 7,2 114 13 2,46 11,7 6 6,0 101 14 2,24 13,1 13 5,7 120 15 1,73 13,4 <5 7,5 167 16 1,46 12,7 <5 7,2 152 17 1,89 8,7 9 7,5 112 18 1,52 8,1 8 10,8 86 19 1,14 9,5 <5 7,8 74 20 2,16 9,0 <5 4,0 93 21 1,49 7,7 <5 5,3 92 22 1,9 10,3 <5 4,8 75 23 2,6 10,7 18 8,0 117 24 1,2 9,5 <5 6,3 111 25 2,57 9,4 6 5,3 115 26 1,25 8,7 <5 6,5 120
3.2.1. Interprétation des données cliniques et discussion
Ces patients admis en diabétologie pour un diabète décompensé présentent également d’autres facteurs de risque de complications (problèmes cardiovasculaires, cécité, amputation) et de stress oxydant.
Chez les patients diabétiques la pression artérielle visée est de 135/85 mmHg, 16 patients hospitalisés présentent une pression artérielle supérieure. Certaines études préconisent même une pression artérielle diastolique (PAD) proche de 80mmHg. L’étude HOT (Hypertension Optimal Treatment) a déterminé, dans une large population, l’objectif tensionnel diastolique permettant d’éviter les complications cardio-vasculaires. Il s’agissait d’une population âgée de 50 à 80 ans, en moyenne 61,5 ans, et une dihydropyridine était utilisée en première intention. En considérant seulement les 1 501 patients diabétiques, le nombre des événements cardio- vasculaires a été réduit de 51 % et la mortalité cardio-vasculaire de 66 % dans le groupe qui avait atteint une PAD moyenne de 81,1 mmHg que dans le groupe de contrôle moins « strict » (PAD moyenne = 85,2 mmHg) (Waeber B et al, 1997). L’hypertension artérielle est responsable d'une production anormale de ROS, notamment par activation des NAD(P)H oxydases et de la chaîne respiratoire mitochondriale, à une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d'azote. Le déséquilibre pro-oxydant entraîne la formation de LDL oxydées et de multiples dysfonctionnements cellulaires : libération de facteurs pro-inflammatoires et de facteurs favorisant la prolifération cellulaire, processus d'apoptose et/ou de nécrose. De plus, le stress oxydant généré entretient cette hypertension artérielle (Beaudeux JL et al, 2006).
A l’entrée d’hospitalisation, les 26 patients sont pesés. 9 patients sont en surpoids (25 < IMC < 30), 4 patients présentent une obésité modérée (30 <IMC <35) et 13 patients présentent une obésité sévère ou morbide (IMC > 35).
La courte durée d’hospitalisation a tout de même permis de montrer une perte de poids en l’entrée et la sortie d’hospitalisation chez 17 patients sur 22. L’IMC moyen est passé de 33,9 ± 6,5 Kg/m² à l’entrée à 33,0 ± 6,1 Kg/m² à la sortie (p<0,05). La lipotoxicité des cellules vasculaires, endothéliales et pancréatiques entre autres est responsable de stress oxydant, comme nous le montre l’étude d’Unger chez des
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souris obèses diabétiques (Unger RH, 1997). L’hyperlipidémie entraine une baisse de l’insulinosécrétion, une activation des protéines inflammatoires, une majoration de l’apoptose et donc une augmentation du stress oxydant.
3.2.2. Interprétation des données biologiques et discussion
Après une durée d’hospitalisation de 5-10 jours selon les patients, les résultats montrent que la concentration urinaire moyenne de 8-IP a baissé de 20% (121 ± 82 à J0 et 105 ± 69 ng/mmol créatinine à la sortie (p<0,0454)). Ainsi chez 15 patients la concentration urinaire de 8-IP est nettement diminuée, chez 6 patients elle est sensiblement stable le temps de l’hospitalisation et chez 4 patients elle a une valeur supérieure à la sortie.
Tableau 8 : Valeurs du 8-IP (ng/mmol créatinine) et des glycémies (g/L) à l’entrée et à la sortie d’hospitalisation. Test apparié de Wilcoxon.
8-IP (ng/mmol créatinine) Glycémie (g/L) N° patient admission sortie admission Sortie
1 91 95 1,29 1,84 2 189 189 1,22 2,11 3 93 98 1,62 0,96 4 54 60 1,76 0,78 5 379 281 1,47 1,93 6 56 37 1,73 1,61 7 232 123 3,84 0,79 8 140 164 2,95 1,49 9 76 79 1,37 1,35 10 324 265 2,56 1,75 11 103 45 2,67 1,67 12 100 57 2,1 1,45 13 83 50 2,46 1,51 14 155 151 2,24 1,61 15 58 51 1,73 1,4 16 94 156 1,46 1,61 17 118 81 1,89 1,39 18 63 74 1,52 1,37
19 20 21 22 23 24 25 26 Moyenne Ecart-type p sortie versus entrée
Lors de l’hospitalisation, pour 21 patients la gly
même normalisée pour 6 patients d’entre eux. La glycémie moyenne a baiss est passée de 1,9 ± 0,7 g/L à l’entrée à 1,4 ± 0,3
5 patients ont une glycémie de sortie supérieure à celle de patients, 4 patients ont aussi le taux d’IP qui a a
Chez 62% des patients, la tendance glycémique suit Par ailleurs on peut noter que l
d’hémoglobine glyquée très élevés sont ceux qui ont hautes. Même si l’hospitalisation courte n’a pas pe 8-IP, celles-ci ont diminuées presque de
La figure 38 montre la répartition des patients sel en 8-IP et en glycémie au cours de l’hospitalisation.
Différence de concentration de 8-IP Sortie-entrée (ng/mmol créat) 114 112 1,14 0,97 177 215 2,16 1,28 70 31 1,49 1,13 53 57 1,9 1,52 106 49 2,6 1,45 61 56 1,2 1,18 75 63 2,57 1,74 83 92 1,25 1,6 121 105 1,9 1,4 82 69 0,7 0,3 0,0454 0,0025
Lors de l’hospitalisation, pour 21 patients la glycémie a nettement diminuée, elle est 6 patients d’entre eux. La glycémie moyenne a baiss
est passée de 1,9 ± 0,7 g/L à l’entrée à 1,4 ± 0,3 g/L à la sortie (p<0,0025).
s ont une glycémie de sortie supérieure à celle de l’entrée. Sur ces 5 patients, 4 patients ont aussi le taux d’IP qui a augmenté pendant l’hospitalisation. Chez 62% des patients, la tendance glycémique suit celle du 8-IP.
Par ailleurs on peut noter que les patients ayant des glycémies à jeun et un taux d’hémoglobine glyquée très élevés sont ceux qui ont des valeurs de 8
hautes. Même si l’hospitalisation courte n’a pas permis de normaliser les valeurs de ci ont diminuées presque de 20% chez ces patients.
La figure 38 montre la répartition des patients selon la variation des concentrations IP et en glycémie au cours de l’hospitalisation.
0,97 1,28 1,13 1,52 1,45 1,18 1,74 1,6 1,4 0,3
cémie a nettement diminuée, elle est 6 patients d’entre eux. La glycémie moyenne a baissé, elle
(p<0,0025).
s ont une glycémie de sortie supérieure à celle de l’entrée. Sur ces 5 ugmenté pendant l’hospitalisation.
es patients ayant des glycémies à jeun et un taux des valeurs de 8-IP les plus rmis de normaliser les valeurs de
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Différence de glycémie sortie-entrée (g/L)
Les points montrant une association entre 8-IP et glycémie se trouvent dans les quarts inférieurs gauche et supérieur droit. Il n’y a pas de corrélation entre la diminution de la 8-isoprostanurie et celle de la glycémie. Le quart supérieur gauche montre les patients chez qui une baisse de glycémie a été notée, sans diminution des concentrations en 8-IP. Le quart inférieur droit est la zone de non diminution de glycémie et de 8-IP. Cette zone ne concerne qu’un seul patient.
Un troisième paramètre, l’hémoglobine glyquée montre des valeurs élevée chez tous les patients (7,7 – 13,4 %). La moyenne de l’hémoglobine glyquée est de 10,2 ± 1,6 %). La courte durée d’hospitalisation n’a pas permis ici de percevoir une baisse mais qui peut être supposé par la prise en charge du diabète et du stress oxydant. L’étude de Griesmacher et al. portant sur 158 patients diabétiques (77 diabétiques de type 1 et 81 patients de type 2), a mis en évidence que les diabétiques de type 2 ont des taux plasmatiques en TBARS (marqueurs du stress oxydant) significativement plus élevés que les diabétiques de type 1. De plus les diabétiques ayant un bon contrôle de leur équilibre glycémique (HbA1c < 6,5 %) ont des valeurs plasmatiques en TBARS plus basses que ceux dont le contrôle de l'équilibre glycémique est moins bon (HbA1c > 6,5 %) (Greismacher A et al, 1995)
.
Dans une étude contrôlée chez 85 patients dont la majorité présentaient un diabète de type 2, une augmentation des concentrations en 8-IP a également été retrouvée, corrélée au déséquilibre glycémique (Davi G et al, 1999). Les auteurs suggèrent que l'existence du stress oxydant peut-être en lien avec la stimulation de l'agrégation plaquettaire stimulée par l'effet pro-inflammatoire de l'acide arachidonique (acide gras oméga-6) à l'origine de la production de 8-isoprostane. Il est suggéré qu'une prise en charge comprenant une supplémentation en anti-oxydants pourrait alors se justifier chez ces patients.
Dans une autre étude contrôlée chez 21 patients avec diabète de type 2, les auteurs ont montré que la cause principale de stress oxydant évalué par l'excrétion de 8-IP était l'existence de variations rapides de la glycémie entre les phases pré- et post- prandiale (Monnier L et al, 2006). Dans cette étude, la majoration de l'HbA1c était
moins spécifique de survenue de stress oxydant que les fluctuations aiguës de glycémie. Notre étude, réalisée sur une durée courte, avec par conséquent de très faibles variations attendues sur l'HbA1c, est en accord avec la suggestion d'un effet à court terme de la baisse de la glycémie sur l'amélioration du stress oxydant.
3.3. Conclusion
La situation de décompensation du diabète de type 2 est accompagnée par un stress oxydant. Celui-ci diminue après une hospitalisation de courte durée. Pendant cette période, la glycémie diminue, sans corrélation avec la diminution de l’excrétion urinaire de 8-isoprostane, suggérant que ces deux paramètres sont indépendants. Le niveau encore élevé d’excrétion urinaire de 8-isoprostane après prise en charge suggère qu’une complémentation nutritionnelle en antioxydants pourrait faire partie de la prise en charge de ces patients.
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CONCLUSION
Le diabète est une pathologie grave qui est liée au développement du stress oxydant. Le concept de « stress oxydant » décrit une situation dans laquelle la cellule est dépassée par la présence excessive des espèces oxygénées réactives toxiques, situation que les chercheurs impliquent dans la plupart des maladies humaines (diabètes, cancers, inflammations, maladies neurodégénératives…).
L’étude du stress oxydant au cours du diabète de type 2 a fait l’objet de nombreux travaux chez l’animal mais peu de données sont disponibles chez l’homme. Il a été montré que se sont les phénomènes d’hyperglycémie chronique et d’hyperglycémie aigüe en cause dans le développement du stress oxydant et des complications diabétiques.
Le but de cette étude est d’évaluer le niveau de stress oxydant chez des patients admis en service d’endocrinologie pour décompensation de diabète de type 2, avec réévaluation de ce marqueur à la sortie. L’hypothèse d’une corrélation entre la baisse de la glycémie et celle du stress oxydant serait intéressante dans la prise en charge future de cette pathologie. Un marqueur spécifique est utilisé, le 8-isoprostane formé par l’action des radicaux libres sur l’acide arachidonique.
Cette étude a permis d’observer, la diminution de l’excrétion urinaire de 8- isoprostane et de celle de la glycémie chez les patients pris en charge, sans qu’il n’y ait de corrélation entre les deux. Par contre, la courte durée d’hospitalisation ne permet de suggérer cet effet régressif du stress oxydant à long terme, ni l’impact de la diminution du stress oxydant sur l’hémoglobine glyquée.
Les perspectives de cette étude seraient d’associer à la prise en charge du diabète chez ces patients, un antioxydant puissant du stress oxydant chez le patient diabétique. De nombreuses études animales sont d’ailleurs en cours sur la recherche d’un antioxydant actif sur le stress oxydant induit par l’hyperglycémie.