Etude sur des cellules TK6

Les études de la radioprotection des cellules TK6 ont été effectuées au Centre Régional de Lutte contre le Cancer Paul Strauss, à Strasbourg, par Pierre Bischoff et Antoine Le Roux.

1.1. Principe

Ces études ont été menées sur des TK6, une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines très radiosensibles, ayant un caryotype stable (47 chromosomes) et dotée d’une protéine p53 fonctionnelle. Cette protéine agit en tant que facteur de transcription et est indispensable au maintien de l’intégrité de la cellule et de ses composants. Lorsque la cellule est soumise à un stress, la protéine p53 est activée et elle va provoquer la transcription de nombreux gènes. Cette activation conduit soit à l’arrêt du cycle cellulaire, de manière à permettre par exemple la réparation de l’ADN endommagé, soit directement à l’apoptose.

Ce test est réalisé dans des flacons de 25 mL en mélangeant 7,5 mL de milieu de culture contenant 2 millions de cellules TK6 (quantité évaluée par un compteur Coulter) et 2,5 mL d’une solution d’antioxydant à 1 mg/mL dans du PBS (Phosphate Buffered Saline). Avant de

mélanger cette solution d’antioxydant avec les cellules, elle est préalablement stérilisée par une filtration sur filtre millipore de 0,22 µm. L’antioxydant est mis en contact avec les cellules une heure avant l’irradiation.

Ensuite, le mélange est soumis à une dose d’irradiation de 8 Gy à l’aide d’un accélérateur linéaire à rayons X. Au bout de 40 h après l’exposition aux rayons X, le milieu de culture est remplacé. Pour cela, la solution contenant les cellules est centrifugée à 20000 tr/min, puis le surnageant est retiré et remplacé par 10 mL de milieu de culture.

solution de TK6 et de l’antioxydant

irradiation 8 Gy

(accélérateur linéaire)

changement de milieu et répartition sur plaque

mesure de la fluorescence ajout Alamarblue solution de TK6 et de l’antioxydant irradiation 8 Gy (accélérateur linéaire) changement de milieu et répartition sur plaque

mesure de la fluorescence ajout

Alamarblue

Figure 73

Ensuite, la croissance des cellules est suivie pendant plusieurs jours et est comparée à celle de cellules irradiées en l’absence d’agent antioxydant. Pour cela, 200 µ L de la solution précédente sont introduits dans cinq puits d’une plaque 96 puits pour permettre d’effectuer plusieurs mesures. Cette opération est réalisée sur la même plaque pour chacun des antioxydants évalués. Pour chaque point de suivi de la croissance ces cellules (à des jours différents), une nouvelle plaque doit être utilisée. Plusieurs plaques sont donc préparées en parallèle en utilisant la même méthode de répartition des solutions.

Le suivi du nombre de cellules vivantes au cours du temps est réalisé à l’aide d’un test à l’Alamarblue®160. Ce test utilise le pouvoir réducteur inhérent des cellules vivantes comme un indicateur de l’activité métabolique. Ce réactif consiste en la réduction de la résazurine, un colorant bleu non fluorescent, en résofurine, qui est un colorant rouge très fluorescent

160

(Schéma 99). L’intensité de la fluorescence est directement proportionnelle aux nombre de cellules vivantes présentes dans le puits.

Schéma 99

Dans le cadre du test sur les cellules TK6, 20 µ L d’Alamarblue® sont introduits dans chaque puits d’une plaque 96 puits préparée précédemment. Celle-ci est ensuite incubée pendant 4 h à 37 °C puis une lecture de fluorescence est réalisée à 590 nm en excitant à 560 nm. La quantité de cellules étant proportionnelle à l’intensité de fluorescence, l’unité arbitraire de fluorescence (UAF) indiquée par le fluorimètre est utilisée comme unité de comparaison de l’efficacité des différents antioxydants.

1.2. Résultats

Les composés sélectionnés ont été évalués en tant que radioprotecteurs à l’aide du test cellulaire décrit précédemment en deux séries successives.

Dans la première série, nous retrouvons l’

α

Figure 74

Dans un premier temps, la toxicité des composés a été estimée en mettant en contact les différentes molécules avec les cellules, sans irradiation. Un suivi de la prolifération cellulaire est alors effectué sur plusieurs jours par la méthode établie précédemment. Le graphique de la Figure 75 représente l’évolution du nombre de cellules au cours du temps. Dans cette série, aucun composé ne semble toxique pour les cellules TK6 puisque la croissance des cellules en présence des antioxydants est comparable à celle des cellules placées dans un milieu de culture en l’absence d’agent de protection (contrôle).

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 contrôle trolox 110a 217f Temps (jour) U A F Figure 75

Ensuite, l’évaluation radioprotectrice a été réalisée en irradiant les cellules TK6 par des rayons X à 8 Gy en présence des antioxydants. Le suivi de la croissance cellulaire, représenté dans la Figure 76, montre que suite à l’irradiation, les cellules irradiées en présence de 110a ou 217f prolifèrent beaucoup mieux que celles de l’échantillon de contrôle ou même que celles irradiées en présence de trolox. En effet, L’utilisation de 217f ou 110a permet une prolifération deux fois plus importante que le contrôle après le 8e jour. Ces résultats montrent bien que les dérivés 110a et 217f ont un effet radioprotecteur sur les cellules TK6.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 contrôle trolox 110a 217f Temps (jour) U A F Figure 76

La deuxième série de composés (Figure 77) a été évaluée en suivant le même déroulement des opérations que la série précédente, à savoir d’abord une étude de toxicité préliminaire, puis l’étude de radioprotection proprement dite.

Figure 77

La Figure 78 montre le suivi de la prolifération cellulaire de l’étude de toxicité des dérivés de la deuxième série. Nous pouvons voir que les composés 122b, 122d et 115a montrent une certaine toxicité sur les cellules TK6. En effet, leur courbe de croissance est totalement différente de celle du contrôle. Cependant, pour 122d et 115a, la courbe redevient normale au bout de 7 jours, tandis que dans le cas de 122b, aucune croissance cellulaire n’est visible pendant toute la durée de l’expérience.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 contrôle 117a 122b 122d 115a 110n 117f 217e Temps (jour) U A F Figure 78

Les cellules ont été ensuite irradiées à 8 Gy par un accélérateur linéaire en présence des différents antioxydants. L’histogramme de la Figure 79 représente le pourcentage relatif du nombre de cellules par rapport au contrôle au bout du quatrième jour de suivi de la prolifération cellulaire.

Tout d’abord, pour les dérivés 122b et 115a, nous observons que la prolifération cellulaire est fortement diminuée par rapport au contrôle. Ceci est dû à leur toxicité, révélée précédemment. En ce qui concerne les composés 117a, 110n et 117f, aucune protection n’est observable, puisque le nombre de cellules présentes au bout de quatre jours est comparable à celui du contrôle. Par contre, les dérivés 122d et 217e montrent une bonne capacité à protéger les cellules TK6 des rayonnements ionisants. En effet, la prolifération cellulaire est augmentée de plus de 50 % par rapport au contrôle en présence de chacun de ces deux dérivés.

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100

117a 122b 122d 115a 110n 117f 217e

% p ro li fé ra ti o n c e ll u la ir e Figure 79 1.3. Conclusion

Ces études de radioprotection sur des cellules TK6, ont montré, tout d’abord, que certains dérivés pulviniques pouvaient être toxiques (122b, 122d et 115a). En effet, la croissance cellulaire est altérée en présence de ces composés. Cependant, seul le dérivé 122b entraîne une perte totale de la croissance cellulaire.

Dans la sélection des produits étudiés, quatre composés ont montré des activités radioprotectrices intéressantes. Il s’agit de l’α-hydroxyester 110a, de l’acide vulpinique 122d, et des deux acides tétroniques 217e et 217f. Ces résultats doivent néanmoins être confirmés en répétant plusieurs fois la même expérience.