2-1-Etapes depuis le prélèvement jusqu’au bloc

Au laboratoire, les prélèvements fixés dans du formol à 10% sont enregistrés afin de les identifier (Annexe n° 7-8).

La fixation a pour buts la conservation des structures et le durcissement des tissus. Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement, par immersion du matériel dans du fixateur (formol à 10%).

L’inclusion a pour but la réalisation de coupes histologiques. Le milieu d’inclusion le plus utilisé est la paraffine.

Comme la paraffine est hydrophobe, le prélèvement doit d’abord subir une déshydratation (par immersion dans des bains d’alcool), puis est immergé dans des bains de xylène puis est infiltré par la paraffine fondue par chauffage (circulation) avant d’être coulé dans un moule contenant de la paraffine fondue (inclusion).

Après refroidissement, on obtient un bloc de paraffine, dur, à l’intérieur duquel la pièce prélevée est incluse.

La méthode histologique utilisée dans notre travail est celle du LVRC décrite en annexe (Annexe n° 7).

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IV-2-1-1-Fixation

Elle a pour buts la conservation des structures et le durcissement des tissus. elle immobilise les tissus dans un état aussi proche que possible de l’état vivant tout en assurant leur conservation et les préparant à la suite des traitements. La fixation s’oppose en effet à l’autolyse des constituants cellulaires sous l’effet des enzymes par dénaturation de ces protéines ; mais aussi à la distorsion des tissus en utilisant un agent chimique de fixation qui agit en inactivant les molécules qui pourraient modifier la morphologie tissulaire tout en préservant l’intégrité du tissu. Cette étape a également d’autres effets : la protection contre l’attaque bactérienne, puisque le tissu peut être dégradé sous l’influence de bactéries. On évite ainsi putréfaction(ou décomposition post-mortem), cytolyse, autolyse. Elle permet enfin d’insolubiliser certains constituants tissulaires et favorise leur durcissement.

Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement, par immersion du matériel dans du fixateur.

Les tissus sont placés dans un volume de fixateur équivalent à 15 à 20 fois le volume de la pièce. De nombreux agents peuvent être utilisés comme fixateurs, le formol en solution tamponnée à 10% se fait par mélange de 10 volumes de formol commercial (40% de formaldéhyde dans de l’eau) avec 90 volumes d’un tampon phosphate à Ph 7,2(ANTOINE, 2010; BANKS,1993 ; SANDRITTER, 1974).

Mais, dans notre cas, on a mélangé 10 volumes de formol commercial avec 90 volumes d’eau distillée.

Les intestins sont coupés à peu près 3 cm de longueur, le ganglion est prélevé entier ainsi que la papille iléo-caecale.

Les prélèvements sont laissés en place dans le liquide fixateur au minimum pendant 24 heures afin de permettre une bonne imprégnation.

On prend en considération la taille des organes pour plus ou moins ajouter le temps de fixation.

Les échantillons subissent une deuxième étape qui est la recoupe pour avoir un échantillon plus petit mais qui doit rester représentatif. Chaque prélèvement doit mesurer maximum 1x2 cm. On le replonge dans un liquide fixateur le Bouin pour au moins 4 à 5 jours.

Il faut noter qu’à cette étape, les prélèvements n’ont pas profité d’un même traitement. Car selon la disponibilité en produits chimiques, certains échantillons sont replongés dans du formol à 10%.

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On les envois au laboratoire où l’on effectue la recoupe proprement dite, les prélèvements sont coupés 1 à 2 mm d’épaisseur et mis dans des cassettes en plastiques à usage unique. Pour éviter de malaxer l'organe, il faut le couper avec un instrument bien tranchant (Photo n°52).

Photo n° 52 : Recoupe

On identifie les cassettes et on les replonge dans le premier bain d’alcool 1 une nuit (Photo n°53).

Photo n° 53: Identification des cassettes. Photo n° 54 : Cassettes après rinçage.

On rince à l’eau du robinet (Photo n° 54).

IV-2-1-2-Circulation

Pour fournir des coupes d’une épaisseur de 5 à 10µm, les tissus doivent avoir une certaine consistance, la rigidité des tissus après fixation étant insuffisante pour réaliser les coupes au microtome. Les pièces sont plongées dans une série de bains adéquats afin d’obtenir une rigidité suffisante pour permettre de les manipuler sans risque de détérioration et faciliter la confection des coupes.

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La circulation ou inclusion, consiste à éliminer l’eau des tissus pour favoriser la pénétration dans le tissu d’une substance qui va lui donner sa rigidité. Le plus souvent, il s’agit de la paraffine. La paraffine est un milieu non miscible à l’eau et à l’éthanol, qui est solide à température ambiante et liquide à une température pouvant aller de 45 à 60°C (Photo n°55).

Photo n° 55 : Paillasse de la fixation, circulation et coloration. 1-Déshydratation à l’alcool. 2-Eclaircissement au Xyl.

3-Déparafinage ou éclaircissement.

4-Réhydratation dans un premier bain d’alcool (1). 5-Réhydratation dans un deuxième bain d’alcool (2).

91 La circulation est divisée en 3 étapes :

A- Déshydratation

La déshydratation débarrasse le tissu de l’eau qu’il contient, la plupart des fixateurs étant majoritairement constitués d’eau. L’agent déshydratant n’est miscible qu’avec l’eau contenue dans les tissus et pénètre ainsi facilement dans les cellules.

Dans notre cas, la déshydratation est faite à l’alcool absolu durant toute une nuit, ensuite dans2 bains d’alcool chacun 30 min (Photo n° 56).

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B- Eclaircissement

Cette étape, également appelée désalcoolisation, consiste à remplacer l’alcool présent dans les tissus par un liquide miscible avec la paraffine (Photo n° 57).

L’alcool est remplacé par un solvant anhydre dont l’indice de réfraction est élevé et dont l’effet est d’augmenter la transparence des tissus. Parmi les agents éclaircissants, on retrouve des hydrocarbures benzéniques dont le plus utilisé est le xylène C6H4(CH3)2.

Photo n° 57: Eclaircissement.

C- Imprégnation

Le but de l’imprégnation est de donner au tissu une consistance homogène et un support intérieur.

Cette étape consiste à éliminer l’agent éclaircissant du tissu et à le remplacer par de la paraffine. Elle a donc lieu à une température proche du point de fusion de la paraffine, aux environs de 56°C, la paraffine nécessitant d’être à l’état liquide pour pouvoir pénétrer correctement dans les tissus.

On a plongé les prélèvements dans un premier bain de paraffine, les prélèvements sont mis à l’étuve à 56°C toute une nuit : c’est l’inclusion en paraffine (Photo n° 58).

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