Estrategia de análisis genético

3.2.1. Etiología molecular de los pacientes SA y SPW.

El diagnóstico de SA y SPW se ha confirmado en los 27 pacientes mediante MS-PCR (Ramsden et al. 2010) con un patrón de metilación característico. Para determinar la etiología molecular se ha establecido un algoritmo de diagnóstico (Figura 3.1). Primero, se ha desarrollado un MLPA a medida (custom MLPA1) que interroga tanto la presencia de deleción como su longitud diferenciando la clase I y la clase II.

En el mismo ensayo se han estudiado 15 muestras de población control.

Si no existe deleción, se realiza el análisis de microsatélites localizados tanto en la región 15q11.2-q13 como fuera de ella para detectar una disomía uniparental (UPD). Los microsatélites, además, permiten confirmar la presencia y el tamaño de las deleciones del cromosoma 15

Figura 3.1. Algoritmo diagnóstico utilizado para determinar la etiología molecular de los pacientes SA y SPW.

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3.2.2. Frecuencia de la inversión 15q11.2-q13 en un estudio caso-control

Casos :

Se han valorado un total de 53 muestras de progenitores con descendencia afectada por SA (10 padres y 11 madres) y SPW (16 padres y 16 madres). Los progenitores se han dividido en diferentes grupos según la etiología molecular de su descendencia para comparar la frecuencia de la inversión 15q11.2-q13 frente a los controles. El grupo de SPW se compone de: siete progenitores con hijos afectos por deleción (dos de clase I y siete de clase II), cinco por UPD y uno por defecto de impronta. El grupo de SA está formado por 10 padres y 11 madres con descendencia por deleción (tres de clase I y ocho de clase II) (Tabla 3.2).

Tabla 3.2. Etiología molecular de los pacientes SA.

Controles:

Se han seleccionado 23 muestras como grupo control para estimar la frecuencia de la inversión 15q11.2-q13 en población general española cuyos criterios de inclusión fueron:

- Edad superior a 18 años.

- Con descendencia no diagnosticada de SA / SPW o trastornos del neurodesarrollo.

3.2.3. Estudio de pacientes SA- like

Se han interrogado 20 pacientes SA-like sin etiología molecular conocida, es decir, con un patrón de metilación normal, sin deleción, ni UPD de la región 15q11.2-q13 y sin mutaciones puntuales en los exones del 7 al 16 del gen UBE3A. Se ha elaborado un algoritmo de diagnóstico para determinar la etiología molecular de los pacientes SA-like (Figura 3.2):

 Utilizando el custom MLPA2 se han analizado 10 regiones asociadas a síndromes con DI en los pacientes SA-like, sus progenitores y dos muestras

Del clase I Del clase II UPD CI

SA ^{3 8}

SPW 2 7 5 1

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liderado por el Dr. Luís Pérez Jurado de la Universidad Pompeu Fabra.

 Se han analizado las regiones subteloméricas mediante el kit comercial MLPA P036C (MRC-Holland) en los pacientes SA-like, sus progenitores y 7 sujetos de población general española.

 Se ha valorado la presencia de CNVs en todo el genoma mediante el a-CGH de Agilent de 244K .

 Confirmación y determinación de la herencia de 72 regiones independientes (con frecuencia poblacional <5% y con genes codificantes) que han sido previamente identificadas como CNVs por el a-CGH mediante el custom MLPA3.

Figura 3.2. Algoritmo diagnóstico utilizado para determinar la etiología molecular de los pacientes SA-like.

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3.2.4. Estudios complementarios

Se ha completado el estudio de las CVNs detectadas en pacientes SA-like por a-CGH mediante la utilización del custom MLPA3 y el custom MLPA3 modificado para:

 Determinar la herencia de las 72 regiones independientes consideradas CNVs mediante custom MLPA3.

 Se ha establecido la frecuencia de las CNVs en un grupo control compuesto por 453 individuos de población general española mediante custom MLPA3 modificado. Las CNVs son una gran fuente de variación entre poblaciones, por tanto, es necesario determinar la frecuencia de las CNVs de nuestra serie para poder comparar estas frecuencias entre pacientes y población general.

 Se ha realizado el cribado mediante el custom MLPA3 modificado en 460 pacientes con TND (276 DI, 164 TEA junto con los 20 SA-like) sin etiología molecular conocida.

Además siete pacientes han sido analizados en mayor detalle:

 Paciente SS5: se ha estudiado la herencia de la duplicación Xp11.23 en los padres, un tío y los abuelos maternos,. También se ha realizado el análisis del polimorfismo de repeticiones cortas o STR situado en el gen del receptor de andrógenos humano (HUMARA) en sangre y saliva para determinar si hay inactivación del cromosoma X en la abuela y la madre.

 Paciente MS4: se ha valorado la herencia de la duplicación Xq28 en los padres, un hermano y una hermana. Además se ha analizado sangre y saliva de la madre y la hermana para determinar la inactivación preferencial del cromosoma X mediante HUMARA.

 Pacientes HI1876 y HI1877: se ha valorado la herencia de la duplicación Xq28 en los padres. Además se ha analizado en ADN de línea celular de la madre y la hermana para determinar la inactivación preferencial del cromosoma X mediante HUMARA.

 Pacientes NS1 y NS2: se ha determinado la herencia de la deleción parcial del gen MYH13 (17p13.1) en los progenitores de estas hermanas. Asimismo, se

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o SNPs poco frecuentes en la familia.

 Paciente SS7: se ha determinado la herencia de la deleción 19q13.41 en los progenitores. Se han secuenciado tanto los exones de los genes codificantes ZNF528 y ZNF534, así como, los exones de los RNAs no codificantes ZNF528-AS1, AK097590 y BX537909 del trío familiar. Además se ha desarrollado un modelo celular de knockdown en las líneas celulares establecidas (LCL) SH-SY5Y de neuroblastoma. Tras la transfección con ARNs de interferencia (siRNA) se ha evaluado la expresión de los ARNs no codificantes, los genes colindantes y los genes implicados en las vías de transmisión y plasticidad sináptica y potenciación a largo plazo mediante QPCR. Las vías de interacción han sido obtenidas a partir del software en línea STRING (<http://string-db.org/>).