Section III.1 : Estimation d’une fonction de réaction pour Haïti
3.1.2 Estimation de la règle de Taylor et de Ball pour Haïti
Os procedimentos descritos a seguir foram realizados na FT-UNICAMP, onde as manipulações foram aplicados às amostras e brancos (água de cultivo), de acordo com o protocolo da USEPA (1992b).
4.2.4.1 Graduação de pH
O pH das amostras e seus respectivos brancos foram ajustados a faixa fisiologicamente tolerável aos organismos teste (6 e 9) com a adição de ácido clorídrico (HCl) 1N e/ou 0,1N (ECIBRA) e hidróxido de sódio (NaOH) 1N e/ou 0,1N (SIGMA - ALDRICH), não permitindo que os reagentes adicionados ultrapassassem 10% do volume inicial da amostra. O ajuste foi realizado com o auxílio de um pHmetro (Marte modelo MB-10) devidamente calibrado, onde a
amostra permaneceu sob agitação magnética até a estabilização da leitura conforme Figura 8 (a) e (b). Após esse processo as amostras foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade conforme protocolos da CETESB (2011).
FIGURA 8 – (a) Fotografia da manipulação de graduação de pH, (b) Ilustração dos procedimentos
aplicados
(a)
pHmetro Marte modelo MB-10 Agitador magnético NaOH e/ou HCl (1N e/ou 0,1N) Amostraarmazenada toxicidade Teste de aguda pH 6 e 9
(b)
4.2.4.2 Aeração com ajuste de pH
As amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) (Figura 9 a) foram dispostas em frascos Erlenmeyers de 500 mL. Em seguida foram posicionadas ao centro de cada recipiente com o auxílio de uma rolha de borracha, com diâmetro de furo aproximadamente 3 vezes maior que da pipeta de vidro de 5 mL, para a retirada de possíveis voláteis. O sistema foi conectado por meio de mangueiras de silicone a uma bomba de aquário e mantidos por 2 horas sob aeração moderada. Ao final do processo, as amostras foram retiradas com as mesmas pipetas utilizadas no processo de aeração, para que não houvesse contato com a parede interna do recipiente. Em seguida o pH das amostras foi ajustado ao pH inicial e as amostras foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade conforme protocolos da CETESB (2011) conforme ilustrado na Figura 9 (a) e (b).
FIGURA 9 – (a) Fotografia da manipulação de aeração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos procedimentos aplicados
(a)
bomba de aquário amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) 2 horas sob aeração moderada ajustado ao pH inicial Amostra armazenada Teste de toxicidade aguda pipeta de vidro de 5 mL Folga na rolha(b)
Fonte: Autoria própria
4.2.4.3 Filtração com ajuste de pH
Alíquotas das amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) (Figura 8 a) foram filtradas a vácuo com membranas esterilizadas de 0,45 µm de porosidade (SeS – ME25/21ST),
previamente lavadas com água ultra pura. Em seguida o pH das amostras foi ajustado ao pH inicial e as amostras foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade conforme protocolos da CETESB (2011) conforme ilustrado na Figura 10 (a) e (b)
FIGURA 10 – (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos
procedimentos aplicados
(a)
amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) Bomba a vácuo membrana esterilizada de 0,45 μm de porosidade (SeS – ME25/21ST) ajustado ao pH inicial Amostra armazenada Teste de toxicidade aguda Amostra filtrada válvula(b)
4.2.4.4 Extração em fase sólida
Para a extração em fase sólida foram empregados cartuchos de fase-reversa C18, modelo C18- 55µm, 70A (Strata) com dimensões de 1000 mg X 6mL adaptados em sistema Manifold conectado a uma bomba de vácuo. Os cartuchos empregados foram ativados passando-se 10 mL de metanol 100%, seguidos de 30 mL de água ultra pura (“Mili Q”). O metanol e a água foram descartados e seguiu-se à extração de aproximadamente 200 mL, volume necessário para realização de teste de toxicidade aguda em diferentes valores de pH (3, inicial e 9) das amostras pela sua passagem através dos cartuchos por gotejamento contínuo e lento, para não provocar a perda de substâncias por carreamento.
Para que não ocorresse sobrecarga dos cartuchos, as amostras foram filtradas em papel filtro modelo Qualy - maioria dos poros de 14 µm (JProlab) antes do processo de extração conforme a descrito anteriormente conforme ilustrado na Figura 11 (a) e (b).
FIGURA 11 – (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos
procedimentos aplicados
(a)
amostras em diferentes valores de
pH (3, inicial e 9) e filtradas em
papel filtro modelo Qualy com maioria dos poros de 14 μm
(JProlab) Bomba a vácuo Cartucho de fase reversa C18, modelo C18- 55μm, 70A (Strata) ajustado ao pH inicial Amostra Armazenada 50 mL Teste de toxicidade aguda Amostra filtrada válvula ativado com 10 mL de metanol
100%, seguidos de 30 mL de água ultra pura (“Mili Q”)
(b)
4.2.4.4.1 Recuperação da toxicidade (metais)
No ensaio de recuperação da toxidade dos possíveis metais retidos nos cartuchos foram utilizados cartuchos de fase-reversa C18, modelo C18/18% (Spe-ed SPE) com dimensões de 1000 mg X 6mL adaptados em sistema Manifold, conectado a uma bomba de vácuo. Os cartuchos empregados foram ativados passando-se 10 mL de metanol 100%, seguidos de 200 mL da amostra de agua em pH 9, logo em seguida o metanol e a água foram descartados e seguiu-se à recuperação de possíveis metais utilizando 50 mL de água de cultivo (meio MS) em pH 3 com passagem através dos cartuchos por gotejamento contínuo e lento.
Para provocar o maior carreamento possível de metais retidos no cartucho, logo a seguir a agua de cultivo extraída teve seu pH ajustado ao pH inicial da amostra, que foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade aguda conforme protocolos da CETESB (2011).
4.2.4.4.2 Recuperação da toxicidade (orgânicos)
Neste ensaio de recuperação da toxicidade dos possíveis compostos orgânicos retidos nos cartuchos foram utilizados cartuchos de fase-reversa C18, modelo C18/18% (Spe-ed SPE) com dimensões de 1000 mg X 6mL adaptados em sistema Manifold conectado a uma bomba de vácuo. Os cartuchos empregados foram ativados passando-se 10 mL de metanol 100%, seguidos de 200 mL da amostra de água em pH 9, logo em seguida o metanol e a água foram descartados e seguiu- se à recuperação de possíveis compostos orgânicos passando-se apenas 2 mL de metanol 100% no cartucho, onde este foi armazenado e posteriormente foram adicionados 150 µL deste metanol utilizado como solvente dos possíveis contaminantes orgânicos para cada 10 mL de água de cutivo (meio MS) e em seguida foram realizados os testes de toxicidade aguda.
4.2.4.5 Adição de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA)
A escolha da concentração de EDTA adicionada na amostra foi baseada em testes preliminares de sensibilidade do organismo-teste ao EDTA (Dinâmica – Limite máximo de impurezas: insolúveis 0,005%, Ácido Nitriloacetico 0,1%, Metais pesados - Max. 50 ppm), onde utilizou-se apenas a maior concentração que não apresentou efeito em testes preliminares. Preparou-se a solução a partir de uma solução estoque de 2 g L-1 preparada em água destilada. A amostra permaneceu em contato com o EDTA sob agitação por cerca de 1 hora para possibilitar as reações do agente quelante, em seguida foram realizados os testes de toxicidade conforme Figura 12 (a) e (b).
4.2.5.6 Adição de Tiossulfato de Sódio
De forma similar ao procedimento anterior, após testes preliminares de sensibilidade do organismo-teste ao tiossulfato de sódio (ECIBRA – Limite máximo de impurezas: insolúveis 0,005%, compostos nitrogenados como N - 0,002%, sulfato e sulfito como SO4 - 0,1%, sulfite (S) - Passa o teste), utilizou-se apenas a maior concentração que não apresentou efeito em testes preliminares. A solução foi preparada a partir de uma solução estoque de 10 g L-1 preparada em água destilada. A amostra permaneceu em contato com o tiossulfato sob agitação por cerca de 1 hora para que ocorresse as reações entre o reagente oxidante e a amostra, em seguida foram realizados os testes de toxicidade conforme Figura 12 (a) e (c).
FIGURA 12 – (a) Fotografia da manipulação de adição de EDTA e tiossulfato de sódio, (b) Ilustração dos
procedimentos aplicados para a adição de EDTA, (C) Ilustração dos procedimentos aplicados para a adição de Tiossulfato de sódio
(a)
maior concentração que não apresentou efeito em testes preliminares Agitador magnético Teste de toxicidade aguda Após 1 horaAmostra bruta + EDTA
solução estoque de 2 g/L preparada em água destilada maior concentração que não apresentou efeito em testes preliminares Agitador magnético Teste de toxicidade aguda Após 1 hora
Amostra bruta + Tiossulfato
solução estoque de 10 g/L preparada em água destilada