3.1. Identification des voies de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 60
3.1.1. Les essais génétiques ne démontrent aucun effet additif de Khd1 et Puf6 sur la
La technique d’essais génétiques basée sur la distribution asymétrique de la protéine Ash1 a été développée par l’équipe de Kim Nasmyth (Jansen et al., 1996). Cette technique de génétique inverse permet d’identifier les facteurs ayant une influence sur la localisation de l’ARNm ASH1 et d’Ash1 par l’observation des phénotypes de croissance associés à la perte de
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la DCA. Localisée dans le noyau, la protéine Ash1 permet notamment la répression transcriptionnelle du gène HO en se fixant sur son promoteur. Ainsi, en insérant le promoteur HO en amont de gènes marqueurs tel que ADE2 et CAN1, la modulation de l’expression de ces deux gènes de sélection est effectuée selon la distribution nucléaire d’Ash1. Dans les souches sauvages, la DCA est produite grâce à la séquestration d’Ash1 dans le noyau de la cellule-fille exclusivement. Tandis que dans les souches ayant un défaut dans la localisation d’Ash1, l’expression des gènes de sélection sera inhibée dans les deux cellules en division et leur niveau d’expression sera pratiquement nul. Ainsi, les gènes ADE2 et CAN1 ont été fusionnés au promoteur HO pour créer les gènes régulateurs hybrides HO-ADE2 et HO-CAN1, par la suite intégrés au génome des levures S. cerevisiæ (Jansen et al., 1996) (Figure 11A).
L’expression du gène ADE2 permet la production de la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase. Cet enzyme est essentiel à la biogenèse de novo des purines chez les levures, lorsque le milieu ne contient pas d’adénine (Dorfman, 1969). Soumis à un environnement où la quantité d’adénine est nulle, seules les levures sauvages ayant une distribution asymétrique d’Ash1 auront la capacité de survivre. Le gène CAN1 code pour une protéine membranaire, l’arginine perméase, qui permet l’introduction de l’arginine environnante dans les levures. Toutefois, cette perméabilité membranaire confère aussi une sensibilité à la canavanine, un homologue toxique de l’arginine. L’expression de CAN1 sera létale pour les levures sauvages exposées à un milieu de sélection contenant de la canavanine. Ainsi, le phénotype de croissance des levures témoigne de la distribution d’Ash1 dans les noyaux selon les milieux de sélection utilisés (Figure 11B).
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Figure 11. Description des essais de génétiques inverses basés sur la distribution asymétrique de la protéine Ash1. (A) Schéma du génome des levures Saccharomyces cerevisiæ utilisées pour les essais génétiques basés sur la localisation de la protéine Ash1 (Jansen et al., 1996). Les séquences codantes ADE2 et CAN1 fusionnées au promoteur du gène HO sont intégrées dans le génome des levures. La protéine Ash1 inhibe la transcription de ces gènes en s’associant au promoteur HO lorsqu’elle est présente dans le noyau. Le gène ADE2 est nécessaire à la biogenèse de novo des purine, alors que le gène CAN1 confère une sensibilité à la canavanine, un homologue toxique de l’arginine. (B) Tableau de croissance
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des souches de levure Saccharomyces cerevisiæ employées pour les essais génétiques basés sur la distribution asymétrique de la protéine Ash1. Les souches sauvages (WT) présentent une distribution asymétrique normale de la protéine Ash1, qui est localisée uniquement dans le noyau de la cellule-fille. Les souches de délétion provoquant la délocalisation de la protéine Ash1 (DEL) entraînent la présence d’Ash1 dans les deux noyaux. La localisation d’Ash1 dans le noyau bloque l’expression des gènes ADE2 et CAN1 de façon modérée (+) auprès des souches WT et de manière élevée (++) dans les souches DEL. La transcription du gène ADE2 permet la survie des cellules-mères des levures WT sur les milieux de sélection sans adénine (-ADE), alors que l’expression du gène CAN1 provoque la mort des cellules-mères des souches WT incubées sur un milieu de sélection composé de canavanine (CAN). À l’opposé, l’expression des gènes ADE2 et CAN1 dans les souches DEL est complètement bloquée par la présence d’Ash1 dans les deux noyaux, ce qui provoque les phénotypes inverses dans les deux milieux de sélections.
Pour établir le nombre de voies de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 à partir des facteurs de répression traductionnelle cytoplasmiques, nous avons effectué la délétion des gènes codants pour Khd1 et Puf6 dans les souches contenant les gènes marqueurs HO-ADE2 et HO-CAN1. Toutefois, il a été précédemment établi que la souche khd1 ne présente pas un phénotype suffisamment prononcé pour être observé à l’aide des essais génétiques sur le milieu de culture sans adénine (Irie et al., 2002). Néanmoins, l’utilisation de souches de délétion des gènes SHE3 ou MYO4 exacerbe le phénotype de la souche khd1, permettant alors l’analyse de l’influence de Khd1 sur la DCA (Irie et al., 2002). Ainsi, les souches de délétion puf6, khd1 et puf6 khd1 ont été construites à partir de la souche sauvage et de la souche de délétion du gène SHE3, she3-1440 (Jansen et al., 1996). Pour permettre l’analyse de la distribution asymétrique d’Ash1, les souches de levure ont été exposées à deux
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milieux de sélection, l’un sans adénine (-ADE) et l’autre contenant l’homologue toxique de l’arginine, la canavanine (CAN 0,05%, -ARG). L’absence d’arginine (-ARG) sur le milieu contenant la canavanine permet d’éviter le bruit de fond expérimental, c’est-à-dire la croissance de levure exprimant le gène CAN1 en utilisant l’arginine au lieu de la canavanine.
Sur le milieu de sélection –ADE, le phénotype de croissance des souches de délétions inoculées est similaire à leur souche d’origine respective (Figure 12A). En effet, la souche sauvage présente le même phénotype de survie cellulaire que les souches puf6, khd1 et puf6 khd1. Ces résultats confirment que la fonction de répression traductionnelle de Khd1 n’est pas observable dans ces conditions (Irie et al., 2002). Ayant un mécanisme de régulation similaire à Khd1, il était attendu que l’influence de Puf6 sur la localisation de l’ARNm ASH1 ne serait pas apparente dans ces mêmes conditions. Toutefois, l’absence des deux facteurs de régulation de la traduction Khd1 et Puf6 ne semble pas amplifier la délocalisation d’Ash1 qui aurait pu être observée par un retard de croissance des souches puf6 khd1. Inversement, toutes les souches contenant la délétion du gène SHE3 démontrent un phénotype sévère de mort cellulaire. Malheureusement, le phénotype de la souche she3-1440 est trop prononcé pour permettre l’analyse de l’influence des délétions KHD1 et PUF6, contrairement au phénotype des souches myo4-910 khd1 (YKEN254), publié précédemment (Irie et al., 2002). D’après les résultats de cet essai génétique, l’absence des facteurs de répression de la traduction Khd1 et Puf6 n’influencerait pas la distribution cellulaire de la protéine Ash1.
Sur le milieu de croissance CAN 0,05%, -ARG, la croissance des souches sauvages semble de moitié moindre comparativement aux souches she3-1440 (Figure 12B). Ce résultat est prévisible, puisque la distribution asymétrique de la protéine Ash1 permet l’incorporation
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de la canavanine auprès d’une levure sauvage sur deux. Toutefois, le phénotype des souches de délétion est majoritairement similaire à celui de leur souche d’origine respective. Seules les souches puf6 et she3-1440 khd1 démontrent une croissance légèrement réduite, comparativement à leur souche de transformation initiale respective. Néanmoins, ces deux souches de délétions ne correspondent pas au même facteur de répression traductionnelle. Ainsi, ces résultats ne permettent pas de tirer de conclusion.
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Figure 12. Essais génétiques basés sur la distribution asymétrique de la protéine Ash1. (A) Analyse de croissance des levures selon l’expression du gène HO-ADE2, dans les souches sauvages K4535 (WT), puf6, khd1 et puf6 khd1 et dans les souches K4822 (she3-1440), she3- 1440 puf6, she3-1440 khd1 et she3-1440 puf6 khd1, inoculées avec un facteur de dilution de 10 sur un milieu nutritif riche (YPD) et un milieu de sélection en absence d’adénine (-ADE). (B) Analyse de croissance des levures selon l’expression du gène HO-CAN1, dans les souches
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sauvages K4535 (WT), puf6, khd1 et puf6 khd1 et dans les souches she3-1440, she3-1440 puf6, she3-1440 khd1 et she3-1440 puf6 khd1, inoculées avec un facteur de dilution de 10 sur un milieu nutritif riche (YPD) et un milieu de sélection en présence de 0,05% de canavanine et en absence d’arginine (CAN 0,05%, -ARG).
De manière générale, les essais génétiques effectués ne démontrent pas un effet additif des facteurs Khd1 et Puf6 sur la régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 et la distribution de Ash1. Pour ce faire, il serait primordial d’observer la fonction connue de répression traductionnelle sur l’ARNm ASH1 des facteurs Khd1 et Puf6. Ainsi, une technique permettant la quantification du niveau d’expression de la protéine Ash1 a par la suite été employée, soit la technique de gènes rapporteurs luciférases.
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