D ESCRIPTION DES ESSAIS DE LABORATOIRE

Historicamente os primeiros FSs utilizados para a ação terapêutica, foram desenvolvidos em três famílias definidas com base nas estruturas químicas dessas moléculas: as porfirinas, as clorinas e os corantes. Comumente essas categorias são divididas em gerações: primeira, segunda e terceira geração. A primeira geração de FSs é representada pelos derivados de hematoporfirina (HpD). Os medicamentos HpD disponíveis no mercado são Photofrin®, Photosan® e Photogem®. Para estudos científicos o Photofrin® foi o primeiro fármaco aprovado para ser utilizado na TFD. Trata-se de uma mistura complexa de monômeros, dímeros e oligômeros de um derivado da Hematoporfirina (HpD) [102]. Com o passar do tempo encontrou-se desvantagens na utilização da primeira geração de FSs, sentindo-se a necessidade de uma segunda geração que foram representadas pelos derivados das porfirinas modificadas, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas e naftalocianinas. Com isto, surge a chamada terceira geração com o objetivo de melhorar a seletividade dos FSs já desenvolvidos até aquele momento, fazendo com que fossem direcionados de maneira específica para o tecido lesionado por células cancerosas, incluindo assim, os compostos da primeira e segunda geração conjugados com alguns veículos biológicos, como anticorpos, nanopartículas, proteínas e peptídeos [5, 9, 102].

Os fotossensibilizadores geralmente são moléculas aromáticas com composição química natural ou sintética que tem a capacidade de absorver um fóton de luz na região do espectro visível (400 a 700 nm), em seguida, transfere a maior parte da energia absorvida para o oxigênio molecular nas proximidades, induzindo a uma série de reações fotoquímicas para produzir agentes tóxicos letais, EROs. As propriedades físico-químicas do FS são importantes para a eficácia da TFD ou IFD [97]. A captação subcelular do FS dependente da sua estrutura química e natureza física, e também da forma como ele é administrado. Acredita-se que a Hematoporfirina foi o primeiro fotossensibilizador moderno a ser descoberto em laboratório, tendo seu isolamento sido realizado pela primeira vez em 1841. No entanto, suas propriedades como um fotossensibilizador não foram descobertas até 1911 [63].

Existem diferentes tipos de FSs e cada um desses tem como alvo diferentes compartimentos celulares, incluindo as mitocôndrias, lisossomos, retículo endoplasmático,

complexo de Golgi, matriz citoplasmática e a membrana plasmática, ou combinações destes compartimentos [98]. O motivo é que embora o princípio fotoquímico seja o mesmo para a aplicação em tratamentos de cânceres e na inativação de microrganismos, existem diferenças nas estruturas dos FSs e alvos celulares. A maioria dos FSs usados na TFD possuem núcleos tetrapirrólicos (formado por quatro anéis pirrólicos que vem do pirrol um composto aromático) como as porfirinas que são caracterizadas pela baixa toxicidade. Já os usados na IFD incluem também outros grupos como as acridinas, que são apresentados com suas estruturas químicas na figura 16 [5, 58].

Figura 16: Estrutura de dois fotossensibilizadores com aplicação em TFD.

Fonte: Adaptado de BAGNATO, 2008 [5].

Para que um composto seja considerado um fotossensibilizador, deve cumprir determinadas características para garantir a eficiência no processo fotodinâmico podendo ele ser no tratamento de enfermidades ou na eliminação de microrganismos. Então as propriedades ideais para a utilização de um fotossensibilizador nesse regime são [10, 99-101]:

 Um largo espectro de atividade que seja independente da resistência a antibióticos.  Quimicamente puro e solúvel em água sendo estável em solução com um pH fisiológico,

para facilidade de aplicação e ser rapidamente eliminado do corpo.  Sensibilidade mínima da pele.

 Alto rendimento para a geração do estado tripleto de longa duração e do oxigênio singleto citotóxico são dois recursos importantes, que influenciam a eficiência do FS.  Alta absorção de luz em comprimentos de onda mais longos (600-950 nm) é importante;

eles devem, idealmente, absorverem a luz no comprimento de onda do vermelho (630 nm), que tem uma maior penetração nos tecidos do que os comprimentos de onda mais curtos. Portanto FSs que absorvem na região de 600-800nm são os preferidos.

 Captação seletiva pelos agentes patogênicos alvos.

 A posse de um amplo espectro de ação contra bactérias, fungos, leveduras, vírus, protozoários, parasitas e especialmente os que são resistentes aos antibióticos convencionais.

 Não específico em termos de segmentação biomolecular.  Fotoestável durante a aplicação.

Com isso é visto que não há um FS perfeito, porém encontrar um agente que agregue o maior número de características expostas acima, para uma aplicação fotodinâmica, acaba se tornado um desafio para pesquisadores do mundo inteiro.

3.6.1 Sal de Curcumina

Com a resistência de microrganismos a diversos antibióticos, buscam-se novas alternativas de tratamentos para esses tipos de patógenos. Uma terapia alternativa que se destaca nesse âmbito é a IFD, porém como já discutido anteriormente para que se tenham resultados satisfatórios, essa terapia necessita de um FS eficaz para sua ativação. Tendo em vista esses aspectos, a busca por novos FSs mais ativos e naturais são comprovadas e necessárias. Os primeiros relatos de que plantas adquiriram fundamental importância em processos de cura, foi na China 3000 a.C. Com isso novas descobertas mostraram a importância de ervas na saúde, na culinária e no preparo de produtos diversos que contribuíram para a abertura de novas e amplas perspectivas na medicina natural.

Um FS natural que está sendo usado para a terapia fotodinâmica é a Cúrcuma, também conhecida como açafrão, açafrão da terra, gengibre dourado emangarataia, é uma planta de nome científico, Curcuma longa L., pertencente à família Zingiberaceae. Trata-se de uma planta perene (figura 17, a), nativa do sul e sudoeste asiático e extensivamente cultivado na Índia, principalmente em Madras, Bengal e Bombay, e também na China, Taiwan, Japão, Indonésia e no continente Africano. A Curcuma longa L. possui diversos princípios ativos, como óleo essencial, resinas, curcumina, turmerona, açúcares, amidos e saponinas, que atualmente enquadram o açafrão no quadro de plantas úteis medicinais [105, 106].

A parte que é utilizada da Cúrcuma é o rizoma (figura 17, b), extensão do caule que une sucessivos brotos, sendo ele piriforme (em formato de pera), arredondado ou ovoide carnudo com ramificações laterais compridas dando origem à chamada “Cúrcuma redonda”,

apresenta um odor agradável, levemente amargo, que lembra o gengibre, possuindo a cor amarelada por fora e alaranjada por dentro [105].

Figura 17: A Cúrcuma (a) planta e (b) rizoma.

(a) (b)

Fonte: (a) http://www.plantasquecuram.com.br/ervas/curcuma.html#.VqevmZorK01. (b) http://www.bibliotecapleyades.net/ciencia/ciencia_industryhealthiermedica187.htm.

Os teores dos pigmentos encontrados no rizoma da cúrcuma são constituídos por três curcuminóides com suas composições químicas: a curcumina ( ), a demetoxicurcumina ( ) e a bisdemetoxicurcumina ( ) representados na

figura 18 [106-108]. A curcumina tem peso molecular de 368,38 g/mol [128] é um dos pigmentos dos curcuminóides da planta sendo o mais utilizado e amplamente pesquisado por ter sido mostrado em vários estudos como um potencial agente antioxidante, antimicrobiano, anti-inflamatório e principalmente, por sua ação anticarcinogênica [18, 23, 126, 127]. Trata-se de um composto polifenólico encontrado na concentração de 2,8 a 8%, obtido a partir do rizoma da Curcuma longa L. e tem como principal característica organoléptica a coloração avermelhada [106].

Figura 18: Estrutura química dos compostos biologicamente ativos a partir do açafrão: (a) Curcumina, (b) Demetoxicurcumina e (c) Bisdemetoxicurcumina.

Fonte: Adaptado de SASIKUMAR, 2005 [109].

Além da sua propriedade como corante, a curcumina possui relevante interesse devido a seus efeitos benéficos no organismo humano. Existem diversos relatos da ação em doenças biliares, doenças hepáticas (auxiliando a redução dos níveis de colesterol) e feridas diabéticas (melhora a cicatrização). Também já foram relatadas as ações antiangiogênicas, capacidade de reduzir o colesterol sanguíneo, apresenta efeitos antitumorais e antiproliferativos contra vários tipos de tumores, tem propriedades anti-inflamatórias além de tratamento de câncer e inativação de bactérias [16, 18, 127].

No decorrer dos tempos foi mostrado à capacidade de inativação de microrganismos (Staphylococcus aureus, Enterococcus, Streptococcus mutans e Staphylococcus epidermidis) utilizando a curcumina como FS na IFD [19-21]. Estes microrganismos são a causa de várias doenças que vão da mais simples como a acne até as mais complexas como a meningite, pneumonia, intoxicação alimentar entre outras, podendo levar o individuo a óbito se não forem tratadas adequadamente [22-24].

Para este trabalho foi usado o sal de curcumina (sintetizado pela PDT Pharma de Cravinhos - SP) numa formulação especial da curcumina para tornar-se solúvel em água, porém mantendo todas as suas propriedades. A figura 19 mostra os espectros de absorção e emissão (no detalhe cubeta com o FS) do sal de curcumina, onde podemos observar a banda de absorção em aproximadamente 420 nm e a fluorescência na região do verde (~550 nm).

Figura 19: Espectros de absorção e emissão do sal de curcumina. No detalhe foto mostrando excitação em 405 nm e fluorescência. 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Fluo

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Comprimento de Onda (nm)

A escolha do sal de curcumina como FS para este trabalho foi baseada em estudos que demonstram a eficácia antimicrobiana e demais efeitos citados acima, porém, principalmente por ser solúvel em água e se tratar de um composto natural, já utilizado como corante e tempero, considerado atóxico.