A passagem de informação do DNA até a síntese da proteína compreende diversos passos nos quais a expressão gênica pode ser controlada: (1) controle pré-transcricional, (2) controle de processamento de mRNA, (3) transporte de mRNA e controle da localização na célula, (4) controle traducional, (5) controle da degradação do mRNA e (6) controle da atividade proteica (Figura 3) (ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, 2008).
Fonte: Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter (2008).
Para a maioria dos genes, os controles pré-transcricionais são os mais importantes (ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, 2008). Esse controle pode ocorrer por diferentes mecanismos a saber: atividade de proteínas regulatórias e fatores de transcrição, modulação da cromatina e metilação de ilhas CpG. O primeiro mecanismo envolve dois elementos principalmente: pequenos trechos de DNA de uma sequência definida (ditas regiões regulatórias) e proteínas de regulação gênica que reconhecem e se ligam a esses trechos. As proteínas de regulação gênica são extensivamente complementares às características da dupla hélice de DNA em regiões regulatórias específicas, que envolvem tipicamente menos de 20 nucleotídeos. Essas proteínas podem ligar-se ao DNA como homodímeros ou como heterodímeros, compostos por duas subunidades diferentes, sendo que os últimos aumentam as possibilidades de ligação ao DNA que essas proteínas podem apresentar. No geral, a regulação gênica em eucariotos envolve muitas proteínas, regiões grandes de DNA e é bastante complexa (ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, 2008). Inicialmente deve-se saber que todos os genes codificadores de proteínas são transcritos pela RNA polimerase II, que necessita de cinco fatores de transcrição (FT) gerais para exercer sua função. O acoplamento desses FT gerais acontece em etapas o que fornece a célula a capacidade de acelerar ou diminuir a taxa de início da transcrição em resposta a proteínas de regulação gênica. Além disso, muitas outras proteínas de regulação gênica podem atuar de grandes distâncias ao longo do DNA, permitindo com que um único gene seja regulado por várias delas (conhecidos como
chamado de “mediador”. Ele é formado por um complexo de 24 subunidades e serve como intermediário entre as proteínas de regulação gênica e a RNA polimerase.
Os trechos de DNA que promovem a regulação gênica são compostos pela região promotora, onde FT gerais e a polimerase se ligam, e todas as regiões reguladoras nas quais as proteínas de regulação gênica se ligam para estimular ou reprimir a expressão dos genes. Os FT gerais são poucos e abundantes na célula, se associando a todos os genes transcritos pela RNA polimerase II. Já as demais proteínas de regulação gênica variam muito e estima-se que 8% do genoma humano (~2.000 genes) codifique essas proteínas (ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, 2008). As proteínas de ativação gênica apresentam dois domínios, um com motivos estruturais que reconhecem as sequências de DNA reguladora e o outro responsável por acelerar a taxa de início da transcrição. Os ativadores têm como função atrair, posicionar e modificar os FT gerais, mediador e RNA polimerase II no promotor, de modo a promover a transcrição. Para isso eles podem inclusive alterar a estrutura da cromatina ao redor do promotor. Os ativadores podem agir em conjunto aumentando ainda mais a taxa de transcrição. Da mesma maneira agem as proteínas de repressão gênica. Uma mesma proteína pode atuar como parte de um complexo que ativa a transcrição ou como parte de um complexo que reprime a transcrição, de forma que proteínas eucarióticas de regulação gênica não são exclusivamente ativadoras ou repressoras, mas dependem da montagem final de todos os componentes do complexo. Essa montagem final depende do arranjo da sequência de DNA da região controladora e de quais proteínas de regulação estão presentes na forma ativa na célula. Assim, o tempo, o local e a taxa de transcrição dos genes em uma determinada condição são determinados pelo tipo de proteínas de regulação gênica que se ligam as regiões regulatórias do DNA.
Com relação ao controle traducional, observa-se um papel importante dos RNAs não codificadores (ncRNAs) na regulação dos RNAs que serão traduzidos em proteína. A definição de ncRNAs é bastante abrangente e engloba todos os tipos de RNA que não apresentam evidência de tradução em proteína. Na bioinformática, ncRNAs são identificados pela falta de quadros abertos de leitura (open reading frame – ORFs), seleção por tamanho e baixa homologia com proteínas conhecidas (MILLIGAN; LIPOVICH, 2015). Além disso, um valor arbitrário de 200 pares de bases é usado para separar os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) de RNAs pequenos não codificantes, como os miRNA (MILLIGAN; LIPOVICH, 2015). Os pseudogenes, cópias de genes
codificadores de mRNA que perderam sua capacidade de codificação de proteínas devido a mutações, também são considerados lncRNAs e devido à alta similaridade, podem regular seus genes parentais (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016).
Estruturalmente, os lncRNAs tem baixo ou nenhum potencial para codificar proteínas e baixa conservação entre espécies, além de não apresentarem um padrão em sua sequência, o que dificulta sua categorização e predição funcional (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016). São, portanto, considerados evolucionariamente menos conservados do que genes codificadores de proteínas, principalmente nos éxons, o que nesse caso não indica falta de função, já que podem dobrar-se em estruturas complexas, mediando o reconhecimento do alvo não só por pareamento de bases, mas também pela interação com sua estrutura terciária (DENIZ; ERMAN, 2017). Outra possibilidade é que essa aparente falta de conservação seja devido ao fato de que as ferramentas de bioinformática disponíveis não são capazes de reconhecer pequenas sequências conservadas, separadas por um longo loop que não é conservado, ideia que se torna plausível devido ao fato das regiões promotoras dos lncRNAs serem tão conservadas quanto as dos mRNAs (DENIZ; ERMAN, 2017). Essa flexibilidade estrutural, sem perder função, pode permitir com que essas sequências evoluam mais rapidamente.
Comparado com genes codificadores de proteínas, os lncRNAs são mais tecido- específicos e apresentam menor nível de expressão, porém, apresentam algumas características em comum como presença de múltiplos éxons, cauda poliA, cap 5’ e podem conter ilhas CpG em suas regiões promotoras (DENIZ; ERMAN, 2017; WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016). Uma forma de classificar os lncRNAs é através da sua localização no genoma, já que eles podem estar localizados (1) em regiões intergênicas, e nesse caso são chamados lincRNA (long intergenic non coding RNA); (2) em introns de genes codificadores de proteínas; (3) na fita oposta de genes codificadores de proteínas; (4) associados a regiões UTR ou promotoras de genes codificadores de proteínas; (5) regiões regulatórias (enhancers); ou ainda (6) ser uma isoforma sem capacidade de codificação de um gene codificador de proteínas (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016).
Os lncRNA estão envolvidos em vários processos biológicos como a modulação da expressão alelo específica e a regulação transcricional e pós-transcricional da expressão gênica, seja por meio de recrutamento de complexos modificadores de cromatina ou através da regulação dos níveis de metilação do DNA, podendo funcionar
como guias e sinalizadores ou ainda precursores ou sequestradores de miRNAs (QUINN; CHANG, 2016). Também podem atuar como sequestradores de fatores de transcrição de seus alvos ou como scaffolds permitindo a formação de complexos multiproteicos (BATISTA; CHANG, 2013). Atuam no splicing alternativo, na formação do corpúsculo de Barr, na atividade de enzimas e podem também ser exportados em vesículas extracelulares e agirem em outras células (SALVIANO-SILVA et al., 2018). Em redes de genes, agem como componente funcional da regulação da expressão gênica, sendo expressos em padrão coordenado com outros genes (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016). São encontrados em maior concentração no núcleo das células onde podem atuar sobre genes próximos de seu sítio de transcrição (cis) ou controlar a expressão de um loci independente em outro cromossomo (trans) (DERRIEN et al., 2012). Enfim, são diversas as formas de atuação desses RNAs, sumarizadas na Figura 4 publicada por Salviano-silva et al. (2018).
Figura 4 - Localização genômica relativa a genes codificadores de proteínas e mecanismos regulatórios de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) no núcleo,
citoplasma e compartimentos extracelulares.
(A) Nomenclatura dos genes lncRNA (elipses douradas), de acordo com sua localização genômica em relação ao gene mais próximo (elipses pretas) e/ou exons de genes codificadores (retângulos pretos). (B) mecanismos reguladores dos lncRNAs: (b1) lncRNA Xist, componente do corpúsculo de Barr em fêmeas; (b2) agindo como enhancers, induzindo transcrição em cis ou em trans; (b3) como captador de proteínas reguladoras, como fatores de transcrição e modificadores da cromatina, bloqueando sua ligação ao DNA; (b4) como sinalizadores moleculares, ativando ou silenciando a expressão gênica através da sinalização para vias de regulação; (b5) guiando proteínas (em geral, modificadores de cromatina) para sítios alvo; (b6) como scaffolds, ligando diferentes proteínas e formando complexos de ribonucleoproteínas, que também afetam a expressão gênica; (b7) interagindo com enzimas, tais como quinases, regulando/intensificando a sua atividade catalítica e alterando a sua sinalização; (b8) modulação de splicing alternativo de transcritos primários; (b9) como RNA endógeno competidor (ceRNA), servindo como uma esponja para microRNAs (miRNAs), bloqueando seu efeito; (b10) visando proteínas, formando complexos moleculares que podem bloquear ou induzir efeitos funcionais, ou mesmo alterar a sua localização na célula; (b11) visando mRNAs, inibindo sua tradução em ribossomos. Além disso, os lncRNAs podem ser (b12) transferidos para outras células por vesículas extracelulares, onde eles podem produzir efeitos; (b13) precursores de miRNAs e outros pequenos RNA reguladores. Um lncRNA pode atuar por múltiplos mecanismos reguladores, tanto no núcleo quanto no citoplasma. O próprio b12 não é exatamente uma característica regulatória, no entanto, a liberação desses lncRNAs funcionais através de vesículas extracelulares é uma maneira de regular genes, RNAs ou proteínas em outros tecidos.
Fonte: SALVIANO-SILVA et al. (2018)
A forma mais comum de inferir o significado dos lncRNAs é através da expressão diferencial, porém, nesse caso, a exata função biológica não é identificada. Assim, metodologias chamas em inglês de guilt-by-association como a clusterização ou
correlação com genes codificadores de proteínas com função conhecida são mais eficazes em tentar prever o papel de lncRNA importantes para determinado fenótipo (SIGNAL; GLOSS; DINGER, 2016). Além disso, a integração com outros conjuntos de dados funcionais, como assinaturas de cromatina e perfis de modificação de histonas, bem como a identificação dos fatores de transcrição responsáveis pela expressão dos lncRNAs também são úteis para anotar funcionalmente lncRNAs.
Em bovinos, um catálogo de lncRNAs em múltiplos tecidos foi publicado (KOUFARIOTIS et al., 2015). Apesar disso, existe pouca sobreposição entre esses e lncRNA encontrados por outros trabalhos (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016). Isso, torna mais uma vez evidente o caráter tecido/célula-específico, tempo-específico e condição-específico dos lncRNAs (WEIKARD; DEMASIUS; KUEHN, 2016).