Enzymes étudiées

Diverses enzymes sont étudiées au sein du groupe Rochefort telles que le glucose oxydase, la laccase, la peroxydase de raifort et la luciférase. Les enzymes sont choisies par pour leur fonctionnalité, leur disponibilité, leur résistance, ou leur possibilité d’accouplement avec un autre système de reconnaissance; ce qui consiste à choisir au moins deux éléments de reconnaissance, dont un doit reconnaître la cible et un ou plusieurs autres doivent amplifier et réaliser la transduction du signal. Dans la section suivante, on énumère les differents raisons pour lesquelles la laccase a été choisie dans le cadre de ce travail.

1.3.1.1.4 Laccase

La laccase est une cuproprotéine thermostable de masse molaire comprise entre 50 et 130 kDa qui a été découverte au Japon en 1883 dans les exsudations de l’arbre Rhus vernicifera , et qui a été, par la suite, trouvée également dans d’autres organismes tels que les bactéries (Azospirilum lipoferum), les insectes (Manduca sexta) et surtout dans plus de cent types de levures (Trametes versicolor, Polysporus versicolor, T. hirsute, T. ochracea,

T. villosa, T. gallica, Cerrena maxima, Coriolopsis polyzona, etc) (25-30).

La laccase est une glycoprotéine hydrosoluble du groupe des polyphénols oxydases bleues (31), capable d’oxyder un grand nombre des molécules aromatiques, surtout celles du type phénolique, mais aussi quelques molécules du type non phénolique (25). Parmi les molécules oxydables par la laccase se trouvent les benzènediols, les polyamines, les aminophénols, les polyphénols et les lignines. L’oxydation de ces substrats implique la réduction de l’oxygène moléculaire vers eau tel qu’indiqué à la Figure 3.

Figure 3. Réaction redox catalysée par la laccase. Adapté de (27, 32).

1.3.1.1.4.1 Site actif de la laccase (cuivres type T1, T2, T3)

La réaction d’oxydoréduction catalysée par la laccase se réalise dans une région appelée site actif (Figure 4), qui contient généralement quatre atomes de cuivre (27). L’arrangement et les liaisons moléculaires des atomes de cuivre jouent un rôle fondamental dans la catalyse des substrats, ces cuivres étant classifiés selon leurs caractéristiques

spectroscopiques et fonctionnelles en trois groupes : type 1 (T1), type 2 (T2) et type 3 (T3). Le groupe T1 inclut un atome de cuivre qui est lié à quatre aminoacides, dont deux sont des histidines, une troisième est une cystéine, qui lui confère une coloration bleue à cause de sa liaison covalente avec le cuivre (absorption à 600 nm), et une quatrième qui est, soit une phénylalanine ou une leucine (quand la laccase provient d’un champignon) ou une méthionine (si la laccase est d’origine bactérienne). Le cuivre T1 est responsable de l’oxydation des substrats grâce à son haut potentiel redox qui va jusqu’à +790 mV par rapport à l’électrode de calomel (27).

Figure 4. Représentation du site actif de la laccase. Adapté de (25).

Le groupe T2 est composé d’un seul cuivre et le groupe T3 est formé de deux cuivres, formant un cluster responsable de la réduction de l’oxygène. Le cuivre T2, coordonné avec deux histidines et une molécule d’eau (25), présente une faible adsorption dans le spectre visible, mais il a des propriétés paramagnétiques en résonance

paramagnétique électronique (RPE). Les cuivres T3 sont liés à trois histidines et sont reliés entre eux par un hydroxyde (25); ils présentent une adsorption dans leur forme oxydée à 330 nm (27). Il a été démontré que le cuivre T2 est nécessaire pour la réduction de l’oxygène moléculaire tandis que le centre formé par les cuivres T3 est requis pour la stabilisation des intermédiaires de nature peroxyde.

1.3.1.1.4.2 Mécanisme catalytique

Le mécanisme d’action de la laccase consiste en l’oxydation du substrat par le cuivre T1, le transfert des électrons depuis T1 vers le cluster T2/T3 (à une distance de ~13 Å) et dans la réduction de l’oxygène moléculaire en eau. Cette réduction implique l’utilisation de quatre électrons en deux étapes : dans la première étape, l’oxygène moléculaire est réduit par le site T2/T3 par l'action de deux électrons pour ainsi produire un peroxyde intermédiaire dont un atome d’oxygène reste lié à T2 et à un des cuivres T3 alors que l’autre atome d’oxygène est lié à l’autre T3. La deuxième étape consiste à réaliser une deuxième réduction à l’aide de deux électrons, ce qui est possible quand les cuivres se trouvent à une distance maximale de 3.3 Å. Cette réduction produit le clivage de la liason entre les deux oxygènes et la formation d’un intermédiaire dit natif relativement stable, ce qui est la clé de l’efficacité du transfert électronique responsable de la réduction du substrat.

1.3.1.1.4.3 Laccase provenant de Trametes versicolor

La laccase provenant de Trametes versicolor (diamètre ~ 5 nm (33, 34)) a été choisie comme point de départ pour nos modifications en conditions industrielles, lesquelles incluent des contraintes mécaniques et thermiques, à cause de sa robustesse et de sa thermostabilité (top E.C. 1,10,3,2: 45-80 °C (26, 35)). De plus, la laccase presente l’avantage

Nous utilisons aussi la laccase comme modèle pour construire du papier bioactif à cause de ses propriétés comme biocapteur et sa capacité à désactiver certaines substances toxiques. En effet, la laccase est capable de détecter et d’inactiver d’elle-même un grand nombre de substances toxiques (36-40). Parmi les substances détectables et inactivables, on trouve différents types d’hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) (38, 41) comme le benzopyrène qui est reconnu pour être une des substances les plus cancérogènes (35). La laccase est aussi capable de détecter des inhibiteurs respiratoires tels que les azidures (N3-)

et les cyanures (CN-_{) (42, 43), et des toxines d’origine naturelle telles que les aflatoxines,}

qui sont des toxines produites par des champignons et qui sont responsables du cancer du foie. Ces toxines sont hautement répandues dans les céréales ; selon l’agence canadienne d’inspection des aliments, elles sont présentes dans 25 % des récoltes mondiales (44, 45). La laccase représente donc une enzyme très intéressante pour le développement du papier bioactif, elle a été déjà immobilisée pour être utilisée pour des applications industrielles sur différentes surfaces avec des résultats prometteurs (25, 46, 47).