Les entreprises concernées doivent identifier et gérer de nouveaux risques

4.2.2.1 Processo de purificação cromatográfica e cristalização do tacrolimo

O processo para a purificação do tacrolimo com alta resolução foi realizado através de dois sistemas cromatográficos e foram baseados nos estudos de separação cromatográfica nas colunas C18 e NH2.

No primeiro sistema de cromatografia líquida adsortiva, a coluna NH2 foi usada

com a fase móvel acetonitrila e água para separar as impurezas altamente solúveis em água do tacrolimo. No sistema seguinte, o tacrolimo foi isolado utilizando diferença de polaridade na coluna de fase reversa C18 e fase móvel composta por acetonitrila e água. No final do processo o tacrolimo foi cristalizado. A purificação foi definida como apresentado nos passos (a), (b) e (c) de purificação.

Passo (a): A amostra pré-purificada foi purificada na coluna recheada com sílica de cromatografia de interação hidrofílica Luna® NH2 e fase móvel constituída por acetonitrila

e água. A banda cromatográfica que contém o tacrolimo eluiu da coluna logo nos primeiros minutos da separação, entre 4,5 e 4,5 minutos. Para diminuir o tempo de ciclo

cromatográfico regenerou-se a coluna com solução aquosa com acetonitrila após a coleta do tacrolimo.

Passo (b): O volume coletado no Passo (a) foi injetado na coluna recheada com a sílica de fase reversa octadecilsilano. Utilizou-se a mesma fase móvel do Passo (a).

Passo (c): O material eluído da coluna C18 foi diretamente coletado e misturado em acetato de etila e resfriado. Após o término da coleta, o material obtido na coluna C18 foi resfriado para facilitar a separação de fases entre a água e os solventes orgânicos acetatos

de etila e acetonitrila. A água presente na amostra foi separada dos solventes orgânicos por um funil de decantação graduado. O volume de acetato de etila com acetonitrila e rico em tacrolimo foi totalmente evaporado. Os cristais formados após a evaporação foram lavados com água e secos em temperatura ambiente.

4.2.2.2 Resultados do processo cromatográfico adsortivo

Para avaliar o processo descrito nos passos (a) e (b) foram preparadas 3 amostras pré-purificadas (APP), provenientes do caldo fermentado preparado de acordo com a Tabela 3.10.

A separação com a coluna semipreparativa NH2 realizada no Passo (a) da

purificação é ilustrada na Figura 4.12 por um dos cromatogramas da separação da APP obtida pela fermentação utilizando maltose como fonte primária de carbono. No cromatograma da APP, nota-se que o tacrolimo não foi totalmente isolado das impurezas. No entanto, a purificação em coluna NH2 eliminou grande parte das impurezas da amostra,

principalmente as impurezas mais solúveis em água. De acordo com o método cromatográfico de quantificação, a concentração de tacrolimo na amostra coletada foi de 545,37 mg/L ± 8,81.

Figura 4.12 – Padrão de tacrolimo e APP do caldo ultilizando maltose em coluna semipreparativa NH2 .

A segunda purificação cromatográfica referente ao Passo (b) foi conduzida na coluna semipreparativa C18 com o material coletado do primeiro sistema cromatográfico. A coleta da banda cromatográfica ocorreu entre os tempos de 15 e 19 minutos. A Figura 4.13 apresenta o cromatograma de uma das injeções na coluna C18 no Passo (b), onde se observa o pico do tacrolimo totalmente isolado das impurezas no tempo de aproximadamente 17 minutos. Após o término da purificação foram obtidos 160 mL de tacrolimo em fase móvel de acetonitrila e água. Determinou-se a concentração de 18,91 mg/L ± 0,37 com o método de quantificação do tacrolimo.

Figura 4.13 – Injeção na coluna semipreparativa C18 para purificação de tacrolimo. Neste estudo experimental não foi realizado o Passo (c) da purificação devido à baixa massa de tacrolimo presente na amostra para ser cristalizado. O volume necessário de acetado de etila (Vcol) pode ser estimado com a Equação 4.1 que utiliza o número de

injeções (Ninj), vazão da fase móvel do sistema cosmográfico (Q) e tempo de coleta (tcol).

Q t N

A Tabela 4.6 apresenta o volume total de injeção (Vinj), volume total coletado (Vcol),

concentração de tacrolimo injetado (Cinj), concentração de tacrolimo no material coletado

(Ccol) e o rendimento. Definiu-se o rendimento como a razão entre a massa de tacrolimo

que entrou e saiu da coluna.

Na purificação com a coluna NH2 o maior rendimento foi do caldo fermentado

produzido com o óleo de castanha-do-brasil, enquanto que o menor foi realizado com o meio proveniente de glicose.

A purificação com a coluna C18 apresentou alto rendimento, próximo dos 100%. O tacrolimo, recém-coletado da coluna C18, apresentou pureza superior a 99% e estava solubilizado em acetonitrila e água.

Tabela 4.6 – Rendimentos da purificação do tacrolimo para fermentações utilizando diferentes amostras pré-purificadas (APP).

Col. APP Vinj (mL) Vcol (mL) Cinj (mg/L) Ccol (mg/L) Rend. (%) NH2 Maltose 3,0 7,50 1438,68 ± 372,80 545,37 ± 8,81 94,77 C18 Maltose 5,6 160,0 545,37 ± 8,81 18,91 ± 0,37 99,09 NH2 Glicose 3,0 7,50 740,94 ± 21,34 235,82 ± 2,92 79,57 C18 Glicose 2,4 56,0 235,82 ± 2,92 10,04 ± 2,92 99,32 NH2 OCB 4,2 6,0 841,48 ± 70,66 571,38 ±178,36 97,00 C18 OCB 2,1 102,0 571,38 ± 178,36 11,59 ± 2,79 98,53

O rendimento do meio fermentado com a glicose na coluna NH2 apresentou baixo

valor em comparação aos outros resultados obtidos na Tabela 4.6. É provável que tal fato tenha ocorrido devido à falha humana no momento da coleta. O experimento não foi novamente realizado, pois gerar a matéria prima necessária através da fermentação e pré- purificação.

4.2.2.3 Cristalização do tacrolimo e fluxograma da purificação.

No Passo (c) foram testados diferentes métodos de cristalização. O maior desafio da cristalização foi a reação de epimerização do tacrolimo com a água presente na fase móvel

que produz o tacrolimo diol (tautômero I) e o tacrolimo C-10 (tautômero II) (Namiki et al., 1995).

Os primeiros estudos de cristalização foram conduzidos com o padrão do tacrolimo. Neste experimento inicial utilizou-se da insolubilidade do tacrolimo em água para a formação dos cristais. O tacrolimo foi solubilizado em uma mistura de acetonitrila e água. A solução foi evaporada e depois resfriada. Os cristais foram filtrados, lavados com água e analisados pelo método de quantificação do tacrolimo.

A Figura 4.14 apresenta o cromatograma obtido, no entanto foi identificado ruídos na linha de base proveniente da decomposição do tacrolimo. Apesar de um ganho significativo, os cristais apresentaram a formação dos epímeros diol (tautômero I) e tacrolimo C-10 (tautômero II).

Figura 4.14 – Cromatograma da primeira cristalização utilizando padrão de tacrolimo.

No procedimento proposto nesta Tese, a solução de acetonitrila e água contendo o tacrolimo obtida ao final do passo (b) foi extraída com acetato de etila. Após a mistura, resfriou-se a solução bifásica. A fase orgânica foi evaporada para cristalizar o tacrolimo.

Os cristais formados foram filtrados, lavados em água e secos em temperatura ambiente. De acordo com o cromatograma dos cristais obtido da Figura 4.15 o tacrolimo apresenta 98% de pureza em relação a sua área cromatográfica que é o mesmo nível de

pureza do padrão da sigma-aldrich. Neste caso, apenas 2% do tacrolimo foram convertidos nos epímeros diol e C-10. É valido ressaltar que a cristalização foi empregada apenas para condicionar o tacrolimo para uma forma de estável. Tal estratégia para cristalização baseou-se em Keri et al. (2005) que realizaram a extração do tacrolimo utilizando um solvente imiscível em água.

Figura 4.15 – Cromatograma do cristal obtido pelo processo de cristalização do Passo (c) da purificação.

Keri et al. (2005) empregaram a extração em outro contexto e sem o recurso da temperatura reduzida. Na circunstância do presente processo, o recurso da temperatura foi primordial para se estabelecer elevada pureza do tacrolimo.

4.3 PROCESSO COMPLETO DE OBTENÇÃO DO TACROLIMO