O OH O O OH OH O HOOC HO HO OH O CH3 2 4 6 8 10 2' 4' 6' 1'' 3'' 5''
6-hydroxykaempférol 6-méthyl éther 7-O-β-glucopyranuronoside (1) (Atraflavoside A)
Ce composé est isolé sous forme d’une poudre jaune. Sa fluorescence jaune terne sous la
lumière UV à 366 nm indique un squelette flavonol. Il s’agit d’un nouveau flavonoïde glycosylé appelé Atraflavoside A.
Le spectre UV de ce composé (Figure III.7) enregistré dans le méthanol présente deux maxima d’absorption : la bande I à 364 nm correspondant au cycle B (cinnamoyle) et la bande II à 256 nm correspondant au cycle A (benzoyle).
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L’addition du trichlorure d'aluminium (AlCl3) provoque un déplacement bathochromique
de 12 nm pour la bande II et de 60 nm pour la bande I. Ce déplacement traduit la formation
d’un complexe d’AlCl3 entre la fonction carbonyle en C-4 et l’hydroxyle en C-5 du cycle A.
La bande I étant inférieure à 435 nm, indique l’absence d’hydroxyle en C-8.
Le spectre IR (Figure III.8) de ce composé montre des bandes d’absorption à 3413 cm-1 (hydroxyle), 1651 cm-1 (γ-pyrone, C-4) et à 1608, 1580, 1510 cm-1 (système aromatique).
Figure III.8: Spectre IR du composé 1
Le spectre de masse, obtenu en mode positif par électrospray ESI (Figure III.9), permet
d’observer plusieurs pics d’ions pseudomoléculaires à m/z 531 [M+K]+
, 553 [(M-H)+Na+K]+
et 569 [(M-H)+2K]+. Le composé 1 a donc une masse moléculaire de 492 uma, soit une formule brute en C22H20O13.
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Cette formule est confirmée par le spectre de masse réalisé en haute résolution HR-ESIMS (Figure III.10) montrant un pic à m/z 569,0101 (calc. C22H19O13K2, 569,0100).
Figure III.10 : Spectre de masse HR-ESIMS du composé 1
Le spectre de RMN 1H du composé 1 enregistré dans le CD3OD (Figure III.11) exhibe un
système A2X2 à δH 8,15 (2H, d, J = 8,9 Hz) et δH 6,93 (2H, d, J = 8,9 Hz), caractéristique d’un
noyau aromatique para-substitué, correspondant aux protons H-2'/H-6' et H-3'/H-5' respectivement. Plusieurs d’autres signaux y ont été observés tels que :
Un signal à δH 6,95 sous forme d’un sigulet s’intégrant pour un proton correspondant soit
au proton H-6 ou H-8 du cycle A;
Un proton anomérique à δH 5,15 (1H, d, J = 7,6 Hz);
Un autre signal singulet s’intégrant pour trois protons à δH 3,92 correspondant à un
méthoxyle;
Des signaux de protons osidiques entre 3,3 et 4 ppm.
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Les spectres RMN 13C et DEPT 135 (Figures III.12 et III.13) révèlent 22 signaux de carbones repartis en 11 carbones quaternaires, 10 méthines et un méthoxyle. Le nombre d’atomes de carbone égale à 22 confirme bien l’existence d’une structure flavonoїdique glycosylé comprenant :
15 atomes de carbone pour la génine (aglycone);
1 atome de carbone correspondant au groupement méthoxyle; 6 atomes de carbone pour la partie osidique.
Figure III.12: Spectre RMN 13C du composé 1
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L’élucidation structurale de ce composé repose principalement sur l’identification de manière séparée de l’aglycone et de la partie osidique.
Partie aglycone
A partir des protons déjà identifiés par RMN 1H, l’expérience HSQC permet de déterminer
les déplacements chimiques des carbones suivants : C-2'/C-6' (δC 129,6), C-3'/C-5' (δC 114,9)
et le méthoxyle à δC 60,1. La grande valeur du déplacement chimique de ce dernier suggère
que les deux positions ortho du noyau A sont substituées. [142,143] Ce qui conduit à placer le groupement méthoxyle en position C-6 ou C-8.
L’analyse conjointe des spectres HMBC et NOESY (Figures III.16 et III.17) permet de visualiser les corrélations suivantes entre:
Les deux protons aromatiques du cycle B H-3’/H-5' et deux carbones quaternaires en 3
J
résonant à δC 122,1 et 159,4 attribuables aisément aux carbones C-1' et C-4' oxygéné
respectivement (Figure III.14);
Les deux protons H-2'/H-6' et deux carbones quaternaires oxygénés à δC 147,8 et 159,4
s’accordant aux carbones C-2 et C-4' respectivement (Figures III.14 et III.15);
Les protons du méthoxyle avec un carbone quaternaire à δC 132 ; l’absence de l’effet NOE
entre ce méthoxyle et le proton H-2' ou H-6' du cycle B indique que la position C-8 est
non substituée, ce qui permet l’emplacement du méthoxyle au niveau du carbone C-6 (δC
132) du cycle A (Figure III.16).
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Le spectre HMBC permet d’observer aussi des taches de corrélations entre le proton H-8 (δH 6,95) et le carbone C-6 déjà assigné et d’autres carbones quaternaires résonant à δC 105,3,
151,8, 156,4 et 176,3 correspondant aux carbones C-10, C-9, C-7 et C-4 respectivement (Figures III.14 et III.15).
Figure III.15 : Corrélations HMBC de la partie aglycone
Figure III.16: Spectre NOESY du composé 1
Les carbones quaternaires oxygénés résonant à δC 135,9 et 151,6 sur le spectre RMN 13C
sont attribuables aux atomes de carbone C-3 et C-5.
Toutes ces données spectrales permettent d’identifier l’aglycone comme étant le 6- hydroxykaempférol 6-méthyl éther (Figure III.17). [144]
OH O OH O OH O O CH3 A C B
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Partie osidique
L’expérience COSY H-H permet d’attribuer les protons de l’unité osidique en révélant la présence d’un système de spins à cinq protons (Figures III.18 et III.19). On y observe les corrélations entre:
Le proton anomérique H-1" [δH 5,15 (d, J = 7,6 Hz)] et le proton H-2" [δH 3,63 (dd, J =
8,9 ; 7,6 Hz)] ;
Le proton H-2" et H-3" [δH 3,54 (t, J = 8,9 Hz)] ;
Le proton H-3" et H-4" [δH 3,58 (m)] ;
Le proton H-4" et H-5" [δH 3,91 (t, J = 9,4 Hz)].
Figure III.18 : Corrélations COSY du sucre
Les constantes de couplage entre tous les protons sont toutes supérieures à 7 Hz indiquant une position transdiaxiale de ces protons. Le proton H-5" qui résonne sous forme d’un doublet avec une constante de couplage J = 9,4 Hz est caractéristique d’un acide glucuronique. [145,146]
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Les déplacements chimiques de leur carbone sont attribués à δC 100,5 (C-1"), 73,2 (C-2"),
76,3 (C-3"), 72 (C-4"), 75,2 (C-5") et 174,8 (C-6"), à partir de l’analyse des spectres RMN
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C et HSQC J-modulé (Figures III.12 et III.20). La grande valeur de la constante de couplage entre les protons H-1"/H-2" (J = 7,6 Hz) indique qu’il s’agit d’un acide β-D- glucuronopyranoique.
Figure III.20: Spectres HSQC de la partie osidique du composé 1
L’expérience de corrélation HMBC (Figure III.21) confirme la nature du sucre par la présence d’une tache de corrélation en 2
J entre le proton H-5" et le carbonyle acide C-6" (δC
174,8) (Figure III.22).
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Figure III.22 : Corrélation HMBC entre H-5" et C-6"
L’analyse du spectre NOESY (Figure III.24) atteste de la position axiale des protons osidiques par la visualisation d’effets nOe entre les protons H-1"/H-3", H-1"/H-5" et H-3"/H- 5" (Figure III.23).
Figure III.23 : Corrélations nOe
La corrélation en 3JH-C observée sur le spectre HMBC (Figure III.21) entre le proton anomère H-1" de l’acide β-D-glucuronopyranoique et le carbone C-7 de l’aglycone (cycle A) permet de déterminer le branchement du sucre à ce carbone, cela est confirmé par l’effet nOe entre le proton H-8 et le proton anomérique H-1" (Figures III.23 et III.24).
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Figure III.25 : Corrélation HMBC H-1"/C-7
L’ensemble de ces données et la mesure du pouvoir rotatoire [α]D = – 51.4° (C = 0,35
g/100 ml, MeOH) permettent d’assigner pour le nouveau composé 1 la structure suivante: 6- hydroxykaempférol 6-méthyl éther 7-O-β-glucopyranuronoside, appelée aussi Atraflavoside A.
Les déplacements chimiques des protons et carbones du composé 1 sont regroupés dans le tableau III.1.
Tableau III.1: Déplacements chimiques RMN 1H et 13C de 1 dans CD3OD
Position δC (ppm) δH (m, J en Hz) 2 147,8 - 3 135,9 - 4 176,3 - 5 151,6 - 6 132 - 7 156,4 - 8 94,2 6,95 (s) 9 151,8 - 10 105,3 - 1' 122,1 - 2' 129,6 8,15 (d, 8,9) 3' 114,9 6,93 (d, 8,9) 4' 159,4 - 5' 114,9 6,93 (d, 8,9) 6' 129,6 8,15 (d, 8,9) 6-OMe 60,1 3,92 (s) 7-O-glucor-1'' 100,5 5,15 (d, 7,6) 2'' 73,2 3,63 (dd, 8,9; 7,6) 3'' 76,3 3,57 (t, 8,9) 4'' 72 3,58 (m) 5'' 75,2 3,91(d, 9,4) 6'' 174,8 -
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