B) Détermination de la concentration de DMSO
4) ELISA
Comme décrit dans la méthodologie, nous avons développé spécifiquement un ELISA permettant de déterminer la présence de fibrinogène de rat. Il s’agit d’un ELISA avec un anticorps de coating fixant le fibrinogène, puis un anticorps portant un réactif (phosphatase alcaline) devenant jaune en présence de diéthanolamine. La lecture de l’ELISA se fait à une DO de 405 nm.
La première partie de la manipulation a consisté à déterminer la courbe standard de lecture permettant de convertir la densité optique en concentration de fibrinogène. Nous avons obtenu la courbe suivante :
Cette courbe nous permet une relativement bonne discrimination des valeurs de concentration de 2 ng/ml de fibrinogène, ce qui est tout a fait satisfaisant.
Nous avons ensuite effectué des tests sur des cultures tridimensionnelles non cryopréservées, laissées en culture 72 heures avant d’être stimulées par de l’interleukine-6 selon un protocole de stimulation à doses croissantes d’Il-6, laissées en présence des hépatocytes 24, 48 ou 72 heures. On obtient les résultats suivants :
Plusieurs commentaires peuvent être faits à partir de ce graphique. On constate d’abord que la synthèse basale, c’est à dire sans stimulation, montre une accumulation du fibrinogène au cours du temps. Ceci nous confirme d’un autre point de vue que nos cellules sont fonctionnelles dans le système de culture retenu.
Des stimulations faibles et de relativement courte durée permettent déjà de doubler la production de fibrinogène. Par la suite, les différentes stimulations par Il-6 montrent une production croissante de fibrinogène selon l’intensité de la stimulation et la durée d’exposition au stimuli.
Synthèse de fibrinogène après cryopréservation :
Le dosage de fibrinogène a ensuite été effectué sur des cultures tridimensionnelles cryoprésevées.
Comparativement au graphique précédent, il faut noter le changement d’échelle de l’abscisse. La synthèse basale est détectable dans la plupart des cultures, mais à des valeurs inférieures au seuil de discrimination de notre test ELISA. En raison du peu de cultures ayant survécu à l’opération, les dosages n’ont été effectués qu’à 72 heures, soit au maximum de production de fibrinogène dans les tests pré cryopréservation. On constate que l’augmentation de production de fibrinogène en fonction de l’intensité de la stimulation est conservée.
1) Isolement cellulaire :
Notre méthode d’isolement cellulaire, adaptée de la méthode décrite par Seglen afin d’effectuer des manipulations stériles, nous permet d’obtenir des cellules de bonne qualité, comme en témoigne leur capacité de mise en culture. La viabilité cellulaire, de l’ordre de 95% au test de l’iodure de propidium, est excellente et, de plus, maintenue à des valeurs permettant des manipulations pendants plusieurs heures après l’isolement.
La purification au Percoll permet de supprimer une grande majorité d’hépatocytes morts, évitant ainsi la lyse de ceux-ci sur les cultures et les dégâts liés au dégagement de toxines. Cette purification permet également de retirer la quasi totalité des cellules non hépatocytaires et d’obtenir ainsi des cultures pures.
2) Cultures tridimensionnelles :
La mise en culture en trois dimensions des hépatocytes effectuée selon la technique décrite dans ce travail permet d’obtenir des résultats intéressants. En microscopie conventionnelle, on constate que les hépatocytes prennent la disposition « en pavé » classiquement décrite en environ 24 heures, ceci avec une mortalité faible, puisqu’au test de bleu Tripan, l’on ne constate en moyenne qu’une centaine de cellules mortes par culture (contenant 2 millions de cellules). Cet aspect cuboïde des cellules est due à la réorganisation du cytosquelette, les micro-filaments d’actine reprenant leur position principale en périphérie des cellules comme le confirme l’étude en microscopie confocale après coloration à la rhodamine. Les autres fonctions de ces micro-filaments d’actine sont également récupérées en particulier le maintien architectural des structures intra-cellulaires et les mouvements des vacuoles, nos cellules étant métaboliquement actives.
La récupération fonctionnelle des cellules est bien démontrée par le test de coloration à la CFDA. Cette molécule est non seulement rendue fluorescente par l’appareil métabolique de la cellule (par estérification), mais doit bien entendu être incorporée, transportée, puis excrétée
dans les néo-canalicules biliaires. Ceci nous semble démontrer une récupération complète des hépatocytes, qui reforme même leur pôles biliaires et «sanguin».
3) Cryopréservation :
La détermination de la courbe de température de refroidissement a été faite avec précision pour les hépatocytes en suspension, et correspond aux données admises dans la littérature. Notre courbe permet en particulier d’éviter les libérations brutales d’énergie liées aux phénomènes de relâchement de chaleur latente de fusion, ce qui a été très largement démontré comme dévastateur pour les structures membranaires.
La concentration de DMSO que nous avons choisie (12.5%) est plus élevée que celle décrite classiquement dans la littérature pour les hépatocytes, qui est plutôt de 10%. Cependant les résultats de survie cellulaire obtenus sur de nombreux échantillonnages nous ont confortés dans cette attitude.
L’application de ces données à la cryopréservation des cultures tridimensionnelles a consisté principalement à modifier les temps d’équilibration des températures, qui ont été prolongés afin de tenir compte de l’épaisseur du matériel à refroidir. On constate que malgré ces adaptations, le résultat morphologique de la cryopréservation de ces cultures est une destruction quasi complète de la structure « boîte de culture (T-flask) – gel – cellules ». En effet, certaines boîtes ont littéralement explosé ; le plus souvent, des fractures sont apparues dans le gel, fragmentant les cellules, et même parfois leurs noyaux.
Il est intéressant de constater pratiquement que la phase de refroidissement semble se passer sans problème particulier, avec des températures réelles correspondant à celles désirées et des structures macroscopiquement conservées en fin de procédure. Il est clair qu’à ces températures, aucun test fonctionnel ne peut être effectué. C’est lors du réchauffement que les dégâts semblent se produire. Cette phase de notre protocole est en effet la partie où il est le plus difficile de respecter les données théoriques. On se souvient en effet que pour éviter les
phénomènes de recristallisation, la vitesse de réchauffement théoriquement adéquate est de 400°C par minute. Cette vitesse est atteignable pour les cellules en suspension dans les tubes de cryopréservation contenant 1.6 ml de solution. Pour des structures de plus grande taille comme celles correspondant au matériel utilisé pour les cultures tridimensionnelles, nous n’avons pu atteindre ni même approcher cette vitesse. Malgré de nombreux essais et modifications techniques, la meilleure vitesse de réchauffement effective atteinte est de 150°C/min.
4. Evaluation fonctionnelle :
La synthèse de fibrinogène basale puis lors d’une stimulation par Il-6 nous confirme par un autre point de vue que la coloration au CFDA que nos cellules en culture tridimensionnelle sont fonctionnelles. En effet, la synthèse basale de fibrinogène montre une accumulation au cours du temps. Logiquement, la stimulation par des doses croissantes d’Il-6 induit la production croissante de fibrinogène.
Les résultats obtenus après cryopréservation permettent un peu plus d’optimisme que les résultats morphologiques. En effet, dans les cultures où suffisamment d’hépatocytes ont survécu, on détecte, bien qu’à des valeurs très faibles, une synthèse basale de fibrinogène. Cette production augmente lors d’une stimulation maximale à l’Il-6, pour atteindre des valeurs au- dessus du seuil de discrimination de notre test ELISA, démontrant ainsi la survie d’hépatocytes.
Le travail effectué dans cette thèse n’a donc pas apporté les fruits espérés quand à la possibilité de créer une banque cellulaire…
Cependant un certains nombres de points positifs sont à relever :
La technique d’isolement cellulaire permet un rendement et une pureté excellents, compétitifs avec les résultats décrits dans la littérature. Cette technique permet donc d’envisager son utilisation dans d’autres contextes, comme par exemple la thérapie génique sur les hépatocytes.
Le point le plus satisfaisant de ce travail est que la culture tridimensionnelle des hépatocytes permet une récupération structurelle et fonctionnelle des cellules, avec une fonction normale tant basale qu’en situation de stimulation. Le test au CFDA nous permet de démontrer que les hépatocytes sont capables d’excréter des métabolites dans les néo-canalicules biliaires. Ceci démontre que la technique d’isolement cellulaire et les manipulations consécutives des cellules ne provoque pas des dommages importants aux structures cellulaires.
Il est clair que la cryopréservation de culture tridimensionnelles, bien que réalisable, n’est pas une technique pertinente dans une application clinique. Bien que cette technique ait également un rendement médiocre, il est probablement plus utile à l’heure actuelle de cryopréserver des cellules en suspension, puis, après réchauffement soit de les utiliser directement pour une thérapie cellulaire soit de les cultiver en trois dimensions afin de leurs restituer leur structure normale. La technique tridimensionnelle est en effet longue et fastidieuse, alors que la cryopréservation en suspension ne prend que peu de temps.
A long terme, une meilleure connaissance de la physique du froid appliquée aux cellules et aux gels, et surtout à leur association intime lors de culture est nécessaire. Ceci nous permettrait de mieux comprendre les phénomènes aboutissant à la destruction des hépatocytes, où des cellules cultivées en général.
Le développement de conteneurs mieux adaptés aux variations de températures extrêmes est également indispensable, sur le même modèle que les cryotubes utilisés pour les suspensions.
D’autre part, alors que les appareils de refroidissement comme le Cryoplaner que nous avons utilisé sont très performants, le développement de techniques et d’appareils de réchauffement beaucoup plus efficients est également nécessaire.
1 BERNUAUD J: Fulminant and subfulminant liver failure: definition and causes. Semin Liver Dis
6: 97-106; 1986.
2 C
HENARD-NEU M. P: Auxiliary liver transplantation: regeneration of the native liver and
outcome in 30 patients with fulminant hepatic failure - a multicenter european study.
Hepatology 23: 1119-1127; 1996.
3 LORETZ L. J: Optimization of cryopreservation procedures for rat and human hepatocytes.
Xenobiotica 19(5): 489-498; 1989.
4 FULLER B. J: Biochemical and ultrastructural examination of cryopreserved hepatocytes in rat.
Cryobiology 19: 493-502; 1982
5 C
OSMAN M. D: An integrated cryomicroscopy system. Cryo-Letters 10: 17-38; 1989.
6 TONER M: Cellular response of mouse oocytes to freezing stress: prediction of intracellular ice
formation. J Biomech Engineering 115: 169-174; 1993.
7 H
ARRIS C. L: Cryopreservation of isolated hepatocytes: intracellular ice formation under
various chemical and physical conditions. Cryobiology 28: 436-444; 1991.
8 H
UBEL A: Intracellular ice formation during the freezing of hepatocytes cultured in a double
collagen gel. Biotechnol Prog 7: 554-559; 1991.
9 B
OREL RINKES I. H. M: Long-term functionnal recovery of hepatocytes after cryopreservation
in a three-dimensional culture configuration. Cell Transplantation 1(4): 281-292; 1992.
10 LEIBO S. P: The role of cooling rates in low temperature preservation. Cryobiology 8: 447-452;
11 M
AZUR P: Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 247: C125-
C142; 1984.
12 MAZUR P: Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mamalian embryos.
Cell Biophysics 17: 53-92; 1990.
13 KARLSSON J. O. M: Nucleation and growth of ice cristals inside cultured hepatocytes during
freezing in the presence of dimethyl sulfoxide. Biophysical Journal 65: 2524-2536; 1993.
14 A
NCHORDOGUY T. J: Insights into the cryoprotective mechanism of dimethyl sulfoxide for
phospholipid bilayers. Cryobiology 28: 467-473; 1991.
15H
OWARD R. B, CHRISTENSEN A. K, GIBBS F. A, PASCH L.A. The enzymatic preparation of
isolated intact parenchymal cells from rat liver. J. Cell Biol. 35: 675-684; 1967.
16B
ERRY M. N, FRIEND D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells - a
biochemical and fine structural study. J Cell Biol 43: 506-520; 1969.
17SEGLEN P. O. Preparation of rat liver cells - Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp
Cell Res 82: 391-398; 1973.
18ORRENIUS S, MOLDEUS P, VADI H, GRUNDIN R. Recent studies on cytochrome P-450-linked
functions in isolated rat liver cells. Forensic Science 6: 67-72; 1975.
19I
CHIHARA A, NAKAMURA T, TANAKA K, TOMITA Y, AOYAMA K, KATO S, SHINNO H.
Biochemical functions of adult rat hepatocytes in primary culture. Ann NY Acad Sci 349: 77-84; 1981.
20 R
EID L. M, JEFFERSON D. M. Culturing hepatocytes and other differentiated cells. Hepatology
4(3): 548-559; 1984.
21T
AKEDA Y, ICHIHARA A, TANIOKA H, INOUE H. The biochemistry of animal cells. I: The effect
of corticosteroids on leakage of enzymes from dispersed rat liver cells. J. Biol. Chem. 239: 3590- 3596; 1964.
22JEEJEEBOY K. N, PHILLIPS M. J. Isolated mammalian hepatocytes in culture. Gastroenterology
71: 1086-1096; 1976.
23S
IRICA A. E, PITOT H. C. Drug metabolism and effects of carcinogens in cultured hepatic cells.
Pharmacological Reviews 31 (3): 205-228, 1980.
24I
YNEDJIAN P. B, MARIE S, GJINOVCI A, GENIN B, SHAO-PING D, BUHLER L, MOREL PH,
MENTHA G. Glucokinase and cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) in the
human liver. J. Clin. Invest. 95: 1966-1973; 1995.
25GOMEZ-LECHON M. J, CASTELLI J, GUILLEN I, O’CONNOR E, NAKAMURA T, FABRA R,
TRULLENQUE R. Effects of hepatocyte growth factor on the growth and metabolism of human
hepatocytes in primary culture. Hepatology 21: 1248-1254; 1995.
26 V
ONS C, PEGORIER J.-P, GIRARD J, KOHL C, IVANOV M.-A, FRANCO D. Regulation of fatty-
acid metabolism by pancreatic hormones in cultured human hepatocytes. Hepatology 13: 1126-1130; 1991.
27 G
UILLOUZO A. Liver cells and drugs.
Les Editions INSERM, Paris and John Libbey Eurotext, London, 1988.
28 M
OSHAGE H. J, ROELOFS H. M. J, VAN PELP J. F, HAZENBERG B. P. C, VAN LEEUWEN M. A,
interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary culture of adult human hepatocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun 155: 112-117; 1988.
29 A
NDUS T, GEIGER T, HIRANO T, KISHIMOTO T, HEINRICH P. C. Action of recombinant human
interleukin-6, interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha on the mRNA induction of acute phase proteins. Eur. J. Immunol. 18: 739-746; 1988.
30 CASTELL J. V, GOMEZ-LECHON M. J, DAVID M, FABRA D. R, TRULLENQUE R, HEINRICH P.C.
Acute-phase response of human hepatocytes: regulation of acute-phase protein synthesis by interleukin-6. Hepatology 12: 1179-1186; 1990.
31H
OLME J. A, SODERLUND E, DYBING E. Drug metabolism activities of isolated rat hepatocytes
in monolayer culture. Acta Pharmacol at Toxicol, 52: 348-356; 1983
32BISSELL D. M, GUZELIAN P. S. Phenotypic stability of adult rat hepatocytes in primary
monolayer culture. Ann NY Acad Sci 349: 85-98;1981.
33 SIRICA A. E Fetal phenotypic expression by adult rat hepatocytes on collagen gel / nylon
meshes. Proc Natl Acad Sci USA 76: 283-287; 1979.
34 C
RANE L. J, MILLER D. L. Plasma protein induction by isolated hepatocytes. Mol Cell
Biochem 53/54: 89-109; 1983.
35 H
UTSON S. M, STISON-FISHER C, SHIMAN R, JEFFERSON L. S. Regulation of albumin synthesis
by hormones and amino-acids in primary cultures of rat hepatocytes. Am J Physiol 252: E291- E298; 1987.
36 JEFFERSON D. M, REID L. M, GIAMBRONE M. A, SHAFRITZ D. A, ZERN M. A. Effects of
dexamethasone on albumin and collagen gene expression in primary cultures of adult rat hepatocytes. Hepatology 5: 14-20; 1985.
37 J
EFFERSON D. M, COBB M.H, GANNARO J. F. et al. Transporting renal epithelium : culture in
hormonally defined serum-free medium. Science 210: 912-914; 1980.
38 C
HERINGTON P. V, SMITH B. L, PARDEE A. B et al. Loss of epidermal growth factor
requirement and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci USA 76: 3937-3941; 1980.
39 G
ATMAITAN Z, JEFFERSON D. M, RUIZ-OPAZO N et al. Regulation of growth and differentiation
of a rat hepatoma cell line by the synergistic interactions of hormones and collagenous substrata. J Cell Biol 97: 1179-1190; 1983.
40 E
NAT R, JEFFERSON D. M, RUIZ-OPAZO N et al. Hepatocyte proliferation in vitro: its
dependence on the use of serum-free, hormonally defined medium and substrata of extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci USA 81: 1411-1415; 1984.
41 PUCK T.T, MARCUS P.I. A rapid method for viable cell titration and clone production with
HeLa cells in tissue culture: the use of X-irradiated cells to supply conditioning factors. Proc
Natl Acad Sci USA 41: 432-437; 1955
42 K
ATZ D. H. Genetic control of cell-cell interactions. Pharmacol Rev 34:51-62; 1982 43 L
EVINE A. J, VAN DEWOUNDE G. S, TOPP G. W et al. Cancer Cells 1/The Transformed Cell.
Cold Spring Harbor Press, New York; 1984.
44B
ISSELL M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a
« normal » cell in culture. Int Rev Cytol 70: 27-100; 1981.
45G
ROBSTEIN C. Inductive epithelio-mesenchymal interactions in cultured organ rudiments of
the mouse. Science 118: 128-137; 1956.
role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog Hormone Res 39: 559-592; 1983.
47Z
ANJANI E. D, RINEHART J. J. Role of cell-cell interaction in normal and abnormal
erythropoiesis. Am J Ped H 2:233-244; 1981.
48 GOULET F, NORMAND C, MORIN O. Cellular interactions promote tissue specific function,
biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes.
Hepatology 8(5): 1010-1018; 1988.
49 M
ICHALOPOULOS G: Primary culture of parenchymal liver cells on collagen membranes.
Morphological and biochemical observation. Exp Cell Res 94: 70-78; 1975.
50 E
LSDALE T, BARD J. Collagen substrata for studies on cell behaviour. J of Cell Biol 54: 626-
637; 1972.
51 HUW A. J, LAWSON H. The effect of different collagen types used as substrata on myogenesis
in tissue culture. Cell Biol Int Rept I 4: 841-850; 1980.
52 ROJKIND M, GATMAITAN Z, MACKENSEN S et al. Connective tissue biomatrix : its isolation and
utilization for long-term cultures of normal rat hepatocytes. J Cell Biol 87: 255-263; 1980.
53 R
EID L. M, GATMAITAN Z, ARIAS I et al.Long-term cultures of normal rat hepatocytes on liver
biomatrix. Ann NY Acad Sci 349: 70-76; 1980.
54 E
HMANN U. K: To grow mammary epithelial cells in culture. J Cell Biol 98: 1026-1032; 1984. 55 B
EN-ZE’EV A: Cell-cell and cell-matrix interactions differentially regulate the expression of
hepatic and cytoskeletal genes in primary cultures of rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2161-2165; 1988.
56 F
UJITA M: Glycosaminoglycans and proteoglycans induce gap junction expression and
restore transcription of tissue-specific mRNAs in primary liver cultures. Hepatology 7(1): 1S- 9S; 1987.
57 BADER A: A stable long-term hepatocyte culture system for studies of physiologic processes:
cytokine stimulation of the acute phase response in rat and human hepatocytes. Biotechnol
Prog 8: 219-225; 1992.
58 D
UNN J. C. Y: Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a
sandwich configuration. FASEB J 3: 174-177; 1989.
59 H
UA T. C, CRAVALHO E. G, JIANG L. The temperature difference across the cell membrane
during freezing and its effect on water transport. Cryo Lett 3: 255-264; 1982.
60 MAZUR P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 143: C125-
C142, 1984.
61 MAZUR P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian
embryos. Cell Biophys 17: 53-92; 1990.
62 M
AZUR P, RALL W. F, LEIBO S. P. Kinetics of water loss and the likelihood of intracellular
freezing in the mouse ova: influence of the method of calculating the temperature dependence of water permeability. Cell Biophys.
63 TONER M, CRAVALHO E. G. Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation
during freezing of biological cells. J. Appl. Phys. 67(3): 1582-1593, 1990.
64 REID D. S. A programmed controlled temperature microscope stage. J Microsc 114: 241-248;
65 C
OSMAN M. D, TONER M, KANDEL J, CRAVALHO E. G. An integrated cryomicroscopy system.
Cryo Lett 10: 17-38; 1989.
66 STEPONKUS P. L, DOWGERT M. F Gas bubble formation during intracellular ice formation.
Cryo Lett 2:42-47; 1981.
67 RALL W. F, MAZUR P, MC GRATH J. J. Depression of the ice-nucleation temperature of rapidly
cooled mouse embryos by glycerol and dimethyl sulfoxide. Biophys J 41:1-12; 1983.
68 L
EIBO S. P, MC GRATH J. J, CRAVALHO E. G. microscopic observation of intracellular ice
formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology 15: 257-271; 1978.
69 LEIBO S. P. .In EVANS J. W, HOLLAENDER A. Genetic engineering of animals. An agricultural
prospective. Eds Plenum, New York; 1986, pp 251-272.
70 OSTASHKO F. I, BEZUGLY N. D, PEVEDERA K. B. 10th International Congress on animal
reproduction and artificial insemination. University of Illinois, 1984, pp 210.
71 S
HABANA M, MC GRATH J. J. Cryomicroscope investigation and thermodynamic modeling of
the freezing of unfertilized hamster ova. Cryobiology 25:338-354; 1988.
72 S
OUZU H, NEI T, BITO M. Water of microorganisms and its freezing, with special reference to
the relation between water content and viability of yeast and coli cells. Low Temp Sci Ser B 19: 49-57; 1961.
73 MAZUR P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates.
74 L
EIBO S. P, MAZUR P, JACKOWSKI S. C. Factors affecting survival of mouse embryos during
freezing and thawing. Exp Cell Res 89: 79-88; 1974.
75 WHITTINGHAM D. G, WOOD M, FARRANT J, LEE H, HALSEY J. A. Survival of frozen mouse
embryos after rapid thawing from -196 degrees C. J Reprod Fertil 56: 11-21; 1979.
76 BANK H. Freezing injury in tissue cultured cells as visualized by freeze-etching. Exp Cell Res
85 : 367-376 ; 1974.
77 R
ALL W. F, POLGE C. Effect of warming rate on mouse embryos frozen and thawed in
glycerol. J Reprod Fertil 70: 285-292;1984.
78 R
ALL W. F, REID D. S, POLGE C. Analysis of slow-warming injury of mouse embryos by
cryomicroscopical and physiochemical methods. Cryobiology 21: 106-121; 1984.
79 R
ALL W. F, FAHY G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by
vitrification. Nature 313 : 573-575 ; 1985.
80 RALL W. F. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification.
Cryobiology 24 : 387-402 ; 1987.
81 MC GRATH J. J, CRAVALHO E. G, HUGGINS C. E. An experimental comparison of intracellular
ice formation and freeze-thaw survival of HeLa S-3 cells. Cryobiology 12: 540-550; 1975.
82 P
ERSIDSKY M. D, LUYET B. J. Analysis of the freezing process across temperature gradients
within gelatin gels. Cryobilogy 12: 364-385; 1975.
83 A
LLENSPACH A. L, KRAEMER T. G. Ice crystal patterns in artificial gels of extracellular matrix
84 M
AZUR P. Physical and chemical basis of injury in single-celled microorganisms subjected to
freezing and thawing. In MERYMAN H. T: Cryobiology, London Academic, 213-315; 1966.
85
GENIN B, Transplantation d’hépatocytes et co-transplantation hépatocytes – ilôts de