Durante o desenvolvimento deste trabalho, o intuito foi avaliar de forma mais abrangente os perfis cromatográficos de amostrasde cacau e derivados, e portanto obter o maior número possível de compostos. Isto porque nos trabalhos que deram sequência à tese, os perfis cromatográficos completos de GC×GC foram avaliados. Com este intuito, a otimização por SPME foi conduzida avaliando-se a área total extraída dos compostos.
Para avaliar as melhores condições de extração um planejamento Doehlert foi utilizado. Ele é um planejamento de segunda ordem, que permite o cálculo de coeficientes quadráticos, sendo possível avaliar diferentes fatores com diferentes números de níveis 59. Além do mais, o número de experimentos necessários para desenvolver o planejamento é menor que outros planejamentos, como o planejamento composto central (CCD) 59.
Nesta etapa, a separação cromatográfica utilizada não propiciou a completa separação dos componentes extraídos, sendo esta otimização realizada posteriormente. As variáveis estudadas neste planejamento foram a temperatura de extração, avaliada entre 40 ºC e 60 ºC, tempo de extração, estudado entre 30 e 60 minutos e volume de solução de NaCl saturada, avaliada de 0 mL a 10 mL, com em cinco replicatas no ponto central. A análise de variância (ANOVA) do modelo utilizando a área total é mostrada na Tabela 3 e na Figura 9 (B) o gráfico de Pareto está representado. Avaliando-se estes resultados, os coeficientes linearesde volume de solução de NaCl e tempo de extração foram significativos juntamente com os coeficientes que regem as interações entre o volume da solução de NaCl e o tempo de extração e o volume de solução de NaCl e temperatura de extração.
Tabela 3: Tabela da ANOVA realizada com os dados do planejamento experimental Doehlert. SS df MS F p (1)tempo de extração/min(L) 17514644 1 17514644 25,14798 0,007413 tempo de extração/min(Q) 626593 1 626593 0,89968 0,396578 (2)Temperatura de Extração/°C(L) 3632090 1 3632090 5,21505 0,084446 Temperatura de Extração/°C(Q) 423367 1 423367 0,60788 0,479142
(3)Volume solução NaCl/ mL(L) 49596650 1 49596650 71,21215 0,001080
Volume solução NaCl/ mL(Q) 1838256 1 1838256 2,63942 0,179566
1L by 2L 1643268 1 1643268 2,35945 0,199330 1L by 3L 42040790 1 42040790 60,36325 0,001479 2L by 3L 41634503 1 41634503 59,77989 0,001507 Falta de ajuste 16156786 3 5385595 7,73278 0,038508 Erro puro 2785853 4 696463 Total SS 188850233 16
Figura 9: Gráfico de Pareto do planejamento experimental Doehlert desenvolvido para otimizar as condições de extração por HS-SPME de amostras de chocolate.
O coeficiente de determinação do modelo (R2) foi 0,899 e a falta de ajuste do modelo foi calculada por um teste F entre a média quadrática da falta de ajuste (MQfajus) e a média quadrática do erro puro (MQep) sendo esta razão (MQfajus / MQep )
igual a 5,799. O valor de F tabelado para 3 e 4 graus de liberdade a 95% de confiança é F3, 4. 95%= 6,59 e como a razão calculada é menor que F tabelado, foi
verificada a ausência de falta de ajuste. Na Figura 10 é mostrada a superfície de resposta obtida para as variáveis tempo de extração (min) e volume de solução NaCl (mL).
20000 15000 10000 5000 0 (A)
Figura 10: Superfície de resposta obtida durante o planejamento Doelhert desenvolvido na otimização das condições de extração.
Avaliando as condições que mostram um maior valor de área total dos picos cromatográficos chegou-se às seguintes condições de extração: temperatura de extração 60 ºC, tempo de extração 50 min e nenhum volume de solução saturada de NaCl, pois o efeito do tempo de extração é positivo (maior tempo, maior área) e o efeito do volume de solução de NaCl saturada tem um valor negativo (menor volume, maior área). A temperatura de extração foi selecionada observando-se o efeito de interação entre a mesma e o volume de solução de NaCl saturada e assim estas condições foram utilizadas para condução de todos experimentos. A temperatura alta encontrada para maior eficiência na extração se justifica pela constante da lei de Henry, que aumenta com o aumento da temperatura, levando a um aumento na concentração do analito no headspace 48.
No trabalho de Ducki et al. 4 foram otimizadas as condições de extração por HS-SPME para produtos derivados de cacau e eles optaram pela fibra DVB/CAR/PDMS 4, assim como no trabalho de Li et al 60 e Magi et al. 8. Para avaliarem a temperatura e tempo de extração, os compostos analisados foram divididos em cinco grupos: terpenos e outros, pirazinas, aldeídos e cetonas semi- voláteis, aldeídos e cetonas voláteis e alcoois e ácidos. Em relação à temperatura, eles verificaram que para os alcoois e ácidos, quanto maior a temperatura, maior a eficiência de extração, enquanto que para os aldeídos e cetonas voláteis o inverso é
verdadeiro (maior temperatura, menor eficiência) 4. Já para as pirazinas e aldeídos e cetonas semi-voláteis a maior eficiência ocorre em 60 ºC, sendo esta temperatura a escolhida para realizar os ensaios 4, sendo a mesma temperatura verificada no trabalho aqui apresentado.
Em relação ao tempo de extração, os compostos mais voláteis tinham uma maior eficiência em torno de 10 a 15 min, e eles observaram um decréscimo destas quantidades após 20 min. Já para os compostos semi-voláteis o melhor tempo foi 30 min (tempo máximo estudado por Ducki et al.4) e o tempo de extração selecionado por eles foi de 15 min. A amostra utilizada no trabalho desenvolvido por Ducki et al. era bem caracterizada e conhecida por ter um baixo teor de gordura 4, podendo o tempo de extração se diferenciar devido a estas diferenças na matriz em relação àquela estudada neste presente trabalho.
A avaliação da extração utilizando apenas a amostra, a amostra e água e a amostra e solução salina foi realizada por eles, e a área dos compostos extraídos foi maior quando foi utilizada apenas a amostra, sendo a maior diferença verificada para os alcoois e ácidos, compostos altamente solúveis em água 4. Dessa forma, eles optaram pela utilização apenas da amostra, por trazer maiores vantagens em relação às outras.
Encerrada esta etapa, foram avaliados cinco jogos de colunas de GC×GC para verificar qual destes levariam a um maior uso do espaço cromatográfico e qual deles levaria a uma sepração mais eficiente dos analitos. Dos cinco jogos estudados, três eram jogos normais, onde a primeira dimensão é apolar e a segunda dimensão é polar, que foram HP5 × SolgelWax, HP5 × IL61 e HP5 × HP50 e os outros dois jogos são reversos, com a primeira dimensão polar e a segunda dimensão apolar, que foram SolgelWax × DB5 e HP50 × DB5. Para avaliar o jogo onde o espaço cromatográfico fosse melhor utilizado, a capacidade de pico de cada um deles foi calculada, assim como a porcentagem do espaço cromatográfico utilizado. O aumento na capacidade de pico é uma das grandes vantagens da GC×GC, sendo geométrico e proporcional à capacidade de pico da segunda dimensão 28, conforme discutido anteriormente.
O cálculo da capacidade de pico e da porcentagem de espaço cromatográfico utilizado foram baseados no trabalho de Gillar et al. 58, que trabalhou com peptídeos em HPLC. O cálculo consistiu em dividir o cromatograma em quadrados menores e verificar aqueles que contém picos cromatográficos e relacioná-los ao número total
de quadrados que o cromatograma continha 58. Omais et al. 51 utilizaram três diferentes métodos para calcular a ortogonalidade e para mostrar a ocupação espacial em quatro diferentes jogos de colunas. Eles verificaram que todos os métodos mostravam o mesmo padrão, mas o método de Gillar et al. 58 mostrava valores menores para ortogonalidade, e Omais et al. atribuiram isso a terem escolhido quadrados muito grandes para representar o cromatograma e que a escolha do tamanho dos quadrados é de suma importância para a determinação correta da ortogonalidade 51.
Para os cromatogramas obtidos para o chocolate, os cromatogramas 2D eram divididos em quadrados e aqueles que continham no mínimo um composto (pico cromatográfico) foram contados (bins). A contagem do número total de quadrados em que o cromatograma foi dividido também foi realizada e chamado de Pmax. A
capacidade de pico foi calculada através da equação (6).
(6)
Os termos P1 e P2 referem-se às capacidades de pico na primeira e segunda
dimensão, e, neste caso, foram iguais respectivamente ao número de quadrados que o cromatograma foi dividido na primeira e na segunda dimensão e o cálculo da porcentagem do espaço cromatográfico utilizado foi desenvolvido através da equação (7).
(7)
Todos os cálculos da capacidade de pico foram realizados em Fortran 90, utilizado na plataforma Linux (Ubuntu 12.04) e as integrações dos picos foram desenvolvidas no GCImage versão 2.1 (Zoex Corporation,EUA). A divisão dos quadrados nos cromatogramas avaliados foi realizada de forma aleatória, pois não há uma regra para esta divisão. A primeira dimensão foi dividida em 50 setores, enquanto a segunda foi dividida em 12 setores, resultando 600 quadrados (bins) e dessa forma P1 = 50 e P2 = 12 e Pmax = 600. Na Figura 11 são mostrados as
porcentagens do espaço cromatográfico utilizado encontradas para cada jogo de colunas.
Figura 11: Porcentagem do espaço cromatográfico utilizado calculado pelo método de Gilar et al. 58.
Para avaliar o melhor jogo de colunas, além da porcentagem do espaço cromatográfico avaliou-se também o número total de picos com áreas superiores a 50. Na Figura 12, o gráfico mostra o número de picos cromatográficos para cada jogo de colunas estudado.
Figura 12: Número de picos integrados com áreas maiores que 50 u.a.em cada jogo de colunas estudado.
O jogo de colunas HP5 × SolgelWax foi aquele com a porcentagem de espaço cromatográfico maior, 22,00% e o HP5 × IL61 foi o segundo maior, com 21,67%. Os cromatogramas em que este espaço cromatográfico foi calculado e o os bins ocupados são mostrados na Figura 13. Além disso, o número de picos para estes dois jogos de coluna foi semelhante (179 e 177) e uma avaliação visual da separação cromatográfica foi realizada.
Na Figura 13 (A) o cromatograma do jogo HP5 × SolgelWax é mostrado e na Figura 13 (C) o cromatograma do jogo HP5 × IL61 pode ser visualizado. A inspeção mais cuidadosa dos cromatogramas revelou que o jogo HP5 × IL61 apresenta um grande alargamento das bandas cromatográficas na segunda dimensão, o que faz com o espaço cromatográfico utilizado seja equivalente ao jogo HP5 × SolgelWax,
22,00 18,50 21,67 16,00 17,83 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
HP5 × SolgelWax HP5 × HP50 HP5 × IL61 SolgelWax × DB5 HP50 × DB5
% do Espaço Cromatográfico 179 132 177 201 227 0 50 100 150 200 250
HP5 × Solgelwax HP5 × HP50 HP5 × IL61 SolgelWax × DB5 HP50 × DB5
mas com resolução dos compostos comprometida e, por isso, este jogo de colunas foi descartado.
Avaliou-se ainda o número de picos cromatográficos com áreas maiores que 50 para os jogos de colunas restantes e chegou-se a 179 para HP5 × SolgelWax, 132 para HP5 × HP50, 201 para SolgelWax × DB5 e 227 para HP50 × DB5. Embora os jogos de colunas HP50 × DB5 e SolgelWax × DB5 apresentem um maior número de picos cromatográficos, a separação dos compostos na segunda dimensão é melhor utilizando o jogo HP5 × SolgelWax, e este foi adotado nos experimentos posteriores para obtenção dos perfis cromatográficos.
Omais et al 51 verificaram que na amostra estudada por eles (óleo obtido da liquefação do carvão) o jogo de colunas que utilizava o maior espaço cromatográfico foi um jogo SolgelWax × DB1, e o segundo era um jogo em que as duas dimensões eram polares, mas separam os analitos por diferentes mecanismos. Assim, eles verificaram que o jogo a ser escolhido depende dos componentes da matriz e das interações com a fase estacionária, não podendo ser generalizado 51.
Para dar sequência ao trabalho, as condições de modulação no jogo de colunas HP5 × SolgelWax foram otimizadas. Períodos de modulação de 4 a 7 s foram testados, sendo que o período de modulação de 6 s apresentou os melhores resultados, pois com 4 e 5 s houve wraparound (quando compostos ficam muito retidos na segunda dimensão e eluem no próximo período de modulação), enquanto utilizando 7 s, a separação na primeira dimensão foi comprometida. Portanto, o período de modulação de 6 s mostrou melhor compromisso com maior separação e menor wraparound e foi utilizado nos experimentos subsequentes.
(A) (F) (B) (G) (C) (H) (D) (I) (E) (J) Figura 13: Cromatogramas obtidos para cada jogo de colunas testado para o chocolate. (A) HP5 × SolgelWax, (B) HP5 × HP50, (C) HP5 × IL61, (D) HP50 × DB5 e (E) SolgelWax × DB5. Em (F), (G), (H), (I) e (J) os cromatogramas representados pelos “bins” preenchidos.