Electrochemical Supercapacitors (ESCs)

O teste de neuritogênese foi realizado por meio da análise de crescimento de neuritos já padronizado no Laboratório de Toxicodinâmica. O teste consiste em uma análise morfológica por meio de imagens retiradas das células em microscópio óptico invertido com contraste de fase em 24, 48 e 72 horas. A porcentagem de células com neuritos foi calculada pelo número de células diferenciadas dividido pelo número de células totais vezes 100 e feita a média das quatro fotos retiradas por campo em um experimento independente realizado em triplicata (totalizando 12 fotos por grupo com n=3). O programa Image J foi utilizado para avaliar o número de células com neuritos. Foram consideradas como células diferenciadas aquelas que possuíam neuritos, ou seja, prolongamentos com tamanho igual ou maior do que o diâmetro do corpo celular (DOS SANTOS et al., 2014; EMERICK et al., 2015; FERNANDES et al., 2015; MARTINS et al., 2015; SANTOS et al., 2015).

As células PC12 foram incubadas em placa (já revestida com poli-L-lisina para facilitar a adesão das células ao fundo do poço) de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o sobrenadante foi descartado e

o meio de diferenciação foi adicionado (F12K Nutriente Mixture Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen e 1% soro equino contendo 100 ng/mL NGF (fator de crescimento neural) foi adicionado (F12K Nutriente Mixture Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen). Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x. As células ficaram

expostas às drogas de teste de duas maneiras diferentes: por todo o período de análise ou por um tempo de trinta minutos, sendo que neste segundo tipo de experimento o meio foi totalmente trocado pelo meio de diferenciação mais NGF.

3.11.1 Efeitos da exposição às drogas por 24 horas, sem NGF (efeito intrínseco) sobre a neuritogênese

As células PC12 foram incubadas em placa revestida com Poli-L-lisina de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o

sobrenadante foi descartado e o meio F12 foi adicionado (F12K Nutriente Mixture

Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen) suplementado com 1% de soro equino e 1%

de mix de antibiótico sem o NGF. Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x (Figura 10).

Figura 10 - Desenho experimental para avaliar o efeito das drogas sobre a neuritogênese (24 horas de exposição, sem NGF: efeito intrínseco).

3.11.2 Efeitos da exposição às drogas por 30 minutos, sem NGF (efeito intrínseco) sobre a neuritogênese

As células PC12 foram incubadas em placa revestida com Poli-L-lisina de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o

sobrenadante foi descartado e o meio F12K foi adicionado (F12K Nutriente Mixture

Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen) suplementado com 1% de soro equino e 1%

de mix de antibiótico. Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). Após 30 minutos, o meio foi retirado e substituído pelo meio de diferenciação sem as drogas-teste sem o NGF. A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x (Figura 11).

Figura 11 - Desenho experimental para avaliar o efeito das drogas sobre a neuritogênese (30 minutos de exposição, sem NGF: efeito intrínseco).

3.11.3 Efeitos da exposição às drogas por 24 horas sobre a neuritogênese

As células PC12 foram incubadas em placa revestida com Poli-L-lisina de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o

sobrenadante foi descartado e o meio F12 foi adicionado (F12K Nutriente Mixture

Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen) suplementado com 1% de soro equino e 1%

de mix de antibiótico. Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x (Figura 12).

Figura 12 - Desenho experimental para avaliar o efeito das drogas sobre a neuritogênese (24 horas de exposição).

3.11.4 Efeitos da exposição às drogas por 30 minutos sobre a neuritogênese

As células PC12 foram incubadas em placa revestida com Poli-L-lisina de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o

sobrenadante foi descartado e o meio F12 foi adicionado (F12K Nutriente Mixture

Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen) suplementado com 1% de soro equino e 1%

de mix de antibiótico. Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). Após 30 minutos, o meio foi retirado e substituído pelo meio de diferenciação sem as drogas-teste. A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x (Figura 13).

Figura 13 - Desenho experimental para avaliar o efeito das drogas sobre a neuritogênese (30 minutos de exposição).

3.11.5 Efeito da exposição às drogas (30 minutos) sobre a neuritogênese, na presença de MPP+ (com troca de meio e adição de MPP+ 100 µM)

As células PC12 foram incubadas em placa revestida com Poli-L-lisina de 24 poços na concentração de 2x105 células por poço (volume final de 300 µL). Após deixar as células aderindo ao poço overnight a 37ºC a 5% de CO2/95% de O2, o

sobrenadante foi descartado e o meio F12 foi adicionado (F12K Nutriente Mixture

Kaighn’s Modification 1x da Invitrogen) suplementado com 1% de soro equino e 1%

de mix de antibiótico. Adicionaram-se os compostos a serem testados juntamente com seus respectivos controles (controle negativo, controle positivo com NGF). Após 30 minutos, o meio foi retirado e substituído pelo meio de diferenciação sem as drogas-teste juntamente com MPP+ na concentração final do poço de 100 µM. A indução de crescimento de neuritos foi visualizada após 24h, 48h e 72h em microscópio óptico invertido com contraste de fase, utilizando o aumento de 40x (Figura 14).

Figura 14 - Desenho experimental para avaliar o efeito das drogas sobre a neuritogênese (30 minutos de exposição com MPP+).