L’activité GTPasique de la sous-unité γdu facteur eIF2 nécessite, chez les Eucaryotes, une stimulation par le facteur eIF5. Cependant, contrairement aux GAPs classiques, eIF5 n’interagit pas directement avec sa GTPase γmais avec la sous-unité eIF2βqui, elle-même,
eIF2Bγ eIF2β 1 131 219 285 K1 K2 K3 C2-C2 241 405 AA1 AA2 eIF5 C-ter eIF2Bε 578 1 712 AA1 AA2 1 eIF3c
est associée à γ. Au vu de cette originalité de partenariat, on peut se demander si le mécanisme général d’action d’eIF5 est similaire à celui des autres GAPs ou si, au contraire, il présente d’autres singularités.
Pour répondre à cette question, une analyse plus approfondie du facteur a été menée. eIF5 interagit avec βvia son domaine C-terminal, mais les 100 premiers résidus d’eIF5 sont également nécessaires pour assurer une parfaite fonction GAP. En effet, un mutant d’eIF5 mammifère, eIF5Δ1-98, est toujours capable de lier eIF2βmais il n’est plus apte à déclencher l’hydrolyse du GTP sur le facteur eIF2 (Das et al., 2001). Ce résultat suggère qu’eIF5 fonctionne comme une GAP classique, interagissant avec sa GTPase par l’intermédiaire de son domaine C-terminal et apportant son activité catalytique par son domaine N-terminal. La validation de cette hypothèse a été apportée en étudiant les résidus arginines et lysines du domaine N-terminal d’eIF5. La mutation systématique en alanine des Arg de ce domaine a montré que le mutant R15A est inactif in vivo. L’Arg15 est donc très probablement l’arginine catalytique de la GAP eIF5 qui intervient au sein d’un « Arginine finger ». De plus, elle est entourée par des résidus hydrophobes, Phe13 et Tyr14 qui pourraient permettre l’ancrage de la boucle catalytique de la GTPase au sein du coeur hydrophobe de sa GAP. Chez les autres GAPs, un ou plusieurs autres résidus Arg ou Lys interviennent de manière secondaire pour stabiliser la position de cette première arginine. Dans le cas d’eIF5, les résidus Lys33 et Lys55 semblent jouer ce rôle car leur mutation en alanine abolit la croissance des souches de levures ΔTIF5 complémentées avec ces mutants. Tous ces mutants sont par contre parfaitement efficaces du point de vue de la liaison à eIF2β: leur rôle est donc bien un rôle catalytique dans l’activation de l’hydrolyse du GTP par eIF2.
Ainsi, eIF5 semble présenter un mécanisme classique d’activation de l’hydrolyse du GTP. Cependant, en l’absence du ribosome, eIF5 seul ne peut promouvoir l’hydrolyse du GTP porté par eIF2 au sein du complexe ternaire (Das et al., 2001). En cela, la sous-unité 40S pourrait constituer une seconde GAP d’eIF2. Au cours de la phase d’élongation, l’activité GTPasique du facteur EF1A est stimulée en présence du ribosome (Dey et al., 1995 ; Mohr et al., 2002). Dans le cas d’EF1A, c’est le motif L7/L12 de la 50S qui stimule l’hydrolyse du GTP. Ce motif pourrait notamment induire un changement conformationnel d’EF1A qui placerait son domaine G dans une conformation catalytiquement active. Dans le cas d’eIF2, la sous-unité 60S n’est pas présente lors de l’hydrolyse du GTP puisqu’eIF2 est relargué de la 40S avant association des sous-unités ribosomales. Cependant, la petite sous-unité ribosomale pourrait elle aussi jouer un rôle dans l’activation conformationnelle d’eIF2, d’autant qu’eIF5 et eIF2γn’interagissent pas directement. Enfin, certains résultats suggèrent qu’eIF5 et eIF2 s’associeraient préalablement à la formation du MFC. Les interactions de ces deux facteurs à eIF3 stimuleraient alors leur recrutement au sein du complexe de prédémarrage (Singh et al.,
2004). Dans ce cas, un moyen de contrôle de l’hydrolyse du GTP doit exister pour empêcher une dissociation prématurée du complexe de préinitiation sur un codon de démarrage erroné. Ce rôle pourrait être joué par eIF1 qui a effectivement un effet inhibiteur sur la fonction GAP d’eIF5 (Unbehaun et al., 2004).
Chez les Archées, aucun homologue d’eIF5 n’est rencontré. Le facteur pourrait avoir une activité GTPasique intrinsèque plus élevée que celle de son homologue eucaryotique. En effet, au sein de la sous-unité eIF2β, une mutation permettant le démarrage sur un codon UUG avait été isolée : le mutant L254P. Ce dernier conférait à eIF2 une activité GTPasique intrinsèque, indépendante d’eIF5, et l’hydrolyse prématurée du GTP conduisait à un démarrage sur le codon mésapparié UUG. Chez aIF2β, un résidu proline est quasi- systématiquement rencontré au niveau de la position équivalente au résidu eucaryotique L254. aIF2β, et par conséquent le facteur aIF2, pourrait avoir une activité GTPasique plus grande qu’eIF2 (Thompson et al., 2000). Dans ce cas, seul le ribosome serait nécessaire en tant que GAP et il pourrait éventuellement fournir l’arginine catalytique. La question de savoir comment l’hydrolyse du GTP est déclenchée chez les Archées reste encore ouverte et il n’est pas exclu qu’un autre facteur, non identifié à l’heure actuelle et non homologue à eIF5, joue le rôle de GAP dans ce mécanisme.
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1) Généralités.
La sous-unité e/aIF2α, codée par le gène SUI2 (Cigan et al., 1989), est une protéine d’environ 36 kDa (voir alignement de séquences en Annexe 3). Tout comme β, la sous-unité αn’interagit qu’avec le noyau central de l’hétérotrimère, à savoir la sous-unité γ(Schmitt et al., 2002). La zone d’interaction entre αet γétait encore inconnue avant ce travail de thèse.
Chez les Eucaryotes, la sous-unité αa un rôle clairement identifié dans la régulation du démarrage de la traduction. En effet, eIF2αpossède un résidu sérine universellement conservé dans son domaine N-terminal (Ser51 chez l’homme et chez la levure). Cette sérine est la cible de kinases spécifiques (PKR, HCR, GCN2 ou PERK) qui la phosphorylent en réponse à diverses conditions de stress. Sous forme phosphorylée, le facteur eIF2 devient alors un inhibiteur compétitif du facteur d’échange eIF2B. Ce dernier reste bloqué sous forme d’un complexe avec eIF2 phosphorylé et il ne peut donc plus recycler le facteur eIF2-GDP natif. La synthèse protéique est ainsi inhibée. Une interaction directe entre eIF2αet les sous- unités régulatrices α, β et δdu facteur d’échange a d’ailleurs été mise en évidence (Krishnamoorthy et al., 2001).
Chez les Archées, le facteur eIF2B est absent. De plus, la Ser51 n’est pas universellement retrouvée dans les séquences d’aIF2α. Ces observations ont donc conduit à l’hypothèse que ce rôle régulateur d’αn’existait pas dans le cas archéen. Cependant, une étude récente a montrée que le résidu Ser48 d’aIF2αde Pyrococcus horikoshii pouvait être phosphorylé in vitro par la kinase PKR humaine (hPKR) ainsi que par une protéine de P. horikoshii, conséquemment identifiée comme étant l’homologue archéen de hPKR (Tahara et al., 2004). Le résidu Ser48 (équivalent Arg52 chez eIF2αde levure) est d’ailleurs très conservé dans toutes les séquences d’aIF2α. Ainsi, chez certaines Archées, un rôle régulateur d’aIF2αdans le démarrage de la traduction pourrait également être envisagé. Dans tous les cas, la fonction remplie par αchez les Archées reste à préciser.
Figure 2.13 : Organisation structurale d’e/aIF2α(Numérotation S. cerevisiae).
Domaine 3
1 93 178 304
Tonneau β Domaine α-hélical
Arg 52 Ser 51
Chez les Eucaryotes, d’autres fonctions pour eIF2αont été proposées. Ainsi, la purification de complexes αγparfaitement actifs dans la formation du complexe ternaire suggérait qu’αparticipe à la liaison de l’ARNt initiateur. La sous-unité αpourrait également lier les acides nucléiques. En particulier, des expériences de cross-linking ont soulevé la possibilité d’une interaction entre eIF2αet l’ARN ribosomal 18S (Westermann et al., 1980). Malgré ces quelques pistes, l’implication d’e/aIF2αdans une fonction autre que celle de régulateur de la traduction eucaryotique reste à définir précisément. Dans ce contexte, l’analyse d’un rôle éventuel de la sous-unité αdans la liaison du Met-ARNti
Met
et dans la fonction générale du facteur aIF2 a constitué un objectif majeur de mon travail de thèse.