Projet II : Chimiorésistance induite par les dérivés organométalliques
3.2.1.1. Effets des dérivés organométalliques sur des lignées cellulaires de cancer
L’analyse par RT-qPCR de l’expression de différents membres de la famille ABC dans des cellules cancéreuses coliques HT-29 (figure 25) et SW480 (figure 26) traitées avec de l’ODC- 2 et du RDC-11 n’est pas en faveur de mécanismes de résistance liés à ces transporteurs. En effet, seule l’expression d’ABCC11 semble légèrement stimulée après traitement des cellules HT-29 avec de l’ODC-2 (IC 50 : 1 µM).
Figure 23 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée HT-29
RTqPCR réalisée après 48h de traitement par RDC-11 ou ODC-2 (Ct : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
Figure 24 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée SW480
RTqPCR réalisée après 48h de traitement par RDC-11 ou ODC-2 (Ct : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
En revanche, dans les cellules HCT116 (figure 27), l’expression des transporteurs ABCG2 (voir publication chapitre 3-2-2, figure S4a), ABCC11 et ABCB1 est légèrement augmentée dans les cellules traitées avec le RDC-11 (1 µM), suggérant l’implication potentielle de ce mécanisme dans la résistance aux dérivés organométalliques. Cependant, cette stimulation reste faible et n’est pas retrouvée dans d’autres lignées de cancer colique (HT-29/TW6 et Caco2/TC7) (figures 28 et 29).
Figure 25 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée HCT116
RT-qPCR réalisée après 48h de traitement par RDC-11 ou ODC-2 (Ct : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
De plus, l’expression accrue de certaines molécules d’efflux (ABCB1, ABCG2 ou ABCC11) en présence de CDX2 (voir projet 1) dans les lignées Caco2/TC7 (différenciation spontanée) ou HT-29/TW6 (induction par la doxycycline) est maintenue, voire diminuée, par le traitement des cellules avec du RDC-11 (figures 28 et 29).
Figure 26 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée HT-29/TW6
RTqPCR réalisée après 48h de traitement par RDC-11 (IC30, 0,5 µM) et 72h d’induction des transporteurs ABCB1 et ABCC11 (via Cdx2) par ajout de doxycycline (dox, 1µg/ml) dans le milieu de culture.
Figure 27 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée Caco2/TC7
RT-qPCR réalisée après 48h de traitement par RDC-11 (IC50, 20 µM) et induction des transporteurs ABCG2 et ABCC11 par différenciation spontanée (11j) comparée à des cellules moins différenciées (1j)
Pour aborder le rôle des transporteurs ABC de manière plus fonctionnelle, j’ai ensuite utilisé des inhibiteurs pharmacologiques (ABCB1 / ABCC1 : vérapamil, 5 µM ; ABCC11 : MK571,
25 µM). J’ai réalisé des tests de survie (MTT) sur des cellules HT29/TW6 traitées à la doxycycline car ceci permet d’induire l’expression de CDX2 et d’accroitre l’expression d’ABCB1 et ABCC11 (voir projet 1). Les résultats obtenus montrent que le verapamil restaure en partie la sensibilité des cellules HT29/TW6 à l’ODC-2 (figure 30 haut), contrairement à l’ODC-3 (figure 31 haut). Le MK571 (figures 30 bas et 31 bas) ne permet pas de restaurer la sensibilité des cellules HT29/TW6 aux deux ODC. Le verapamil n’a pas non plus d’effet sur la survie de cellules HCT116 traitées à l’ODC-2 (voir publication chapitre 3-2-2, figure S4).
Figure 30 : Test de survie après traitement par ODC-2 (lignée HT-29/TW6)
MTT réalisé après 48h de traitement par l’ODC-2 et 72h d’induction des transporteurs ABCB1 et ABCC11 (via Cdx2) ajout de doxycycline (dox, 1µg/ml) dans le milieu de culture et en présence d’inhibiteurs de ces transporteurs (verapamil 5 µM et MK571 25 µM)
Figure 31 : Test de survie après traitement par ODC-3 (lignée HT-29/TW6)
MTT réalisé après 48h de traitement par l’ODC-3 induction des transporteurs ABCB1 et ABCC11 (via Cdx2) ajout de doxycycline (dox, 1µg/ml) dans le milieu de culture et en présence d’inhibiteurs de ces transporteurs (verapamil 5 µM et MK571 25 µM)
L’ensemble de ces résultats indique que le RDC-11, l’ODC-2 et l’ODC-3 ont des effets légèrement différents selon les lignées sur l’expression des molécules d’efflux, mais n’induisent
pas une forte expression de ces molécules. Contrairement à l’ODC-3, l’ODC-2 semble sensible à la résistante induite par ABCB1 et ABCC11 dans les cellules HT29.
Plus globalement, cette étude a permis de mettre en exergue le lien entre la cytotoxicité, l’altération du potentiel redox et la production de ROS des dérivés testés. Un article, où je suis
en position de 2ème auteur, a été soumis pour publication une première fois (JACS, IF 13,8),
mais n’ayant pas été accepté doit être soumis à un autre journal.
3.2.1.2. Effets des dérivés organométalliques sur des lignées cellulaires de cancer gastrique
Impact des dérivés organométalliques sur la survie des cellules cancéreuses gastriques
J’ai dans un premier temps réalisé des manipulations préliminaires afin de déterminer l’IC50 de différentes drogues (notamment celles utilisées classiquement en pratique clinique dans les cancers gastriques) sur des lignées cancéreuses gastriques AGS et Kato III après 48h de traitement. Les tests répétés de survie par MTT avec du 5-FU, de l’oxaliplatine, du cisplatine, de l’épirubicine et du RDC-11 ont permis de déterminer les IC50 suivantes :
Lignées
AGS Kato III
Cytotoxiques 5-FU 50 µM 15 µM Oxaliplatine 4 µg/mL 2 µg/mL Cisplatine 25 µM 20 µM Epirubicine 0,15 µg/mL 0,10 µg/mL RDC-11 2 µM Non réalisé
Impact des dérivés organométalliques sur l’expression de molécules d’efflux
Dans un second temps, j’ai examiné par RT-qPCR l’expression de molécules d’efflux dans les cellules AGS et Kato III traitées ou non à l’IC50 de certaines des drogues précédemment testées. L’oxaliplatine et le 5-FU ne semblent pas stimuler de façon importante l’expression des transporteurs ABCB1, ABCC1, ABCC10, ABCC4 et ABCC5 dans les cellules AGS (figure 32 haut) et Kato III (figure 33). En revanche, l’expression d’ABCG2 est fortement diminuée (figures 32 haut et 33). Le 5-FU induit une légère augmentation de l’expression d’ABCC11 dans les 2 lignées cellulaires. De façon intéressante, le traitement de cellules AGS par le RDC- 11 ne semble pas non plus stimuler l’expression des molécules d’efflux testées (figure 32 bas). En revanche, l’épirubicine induit massivement l’expression des transporteurs ABCB1 (x35), ABCC11 (x37) et ABCG2 (x15) dans la lignée AGS et également, mais dans une moindre mesure, celle des transporteurs ABCB1 et ABCG2 dans la lignée Kato III (figure 34).
L’ensemble de ces données suggère que le RDC-11, comparé aux autres drogues classiquement utilisées dans le traitement des cancers gastriques, semble avoir un effet cytotoxique important et n’induit pas de mécanisme de résistance type efflux par les transporteurs de la famille.
Ces résultats pourraient servir de base à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance à la chimiothérapie dans les cancers gastriques.
Figure 32 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée AGS
RT-qPCR réalisée après 48h de traitement par l’IC50 de l’oxaliplatine (4 µg/mL), du 5-Fluorouracile (5-FU, 50 µM) et du RDC-11 (2 µM)). (Control : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
0 1 2 OXALIPLATINE 5-FU Ex pr es si on r el at iv e de l' A R N m control ABCB1 ABCG2 ABCC11 ABCC1 ABCC10
Figure 33 : Expression des transporteurs ABC dans la lignée Kato III
RTqPCR réalisée après 48h de traitement par l’IC50 de l’oxaliplatine (2 µg/mL) et du 5-Fluorouracile (5-FU, 50 µM).
(Control : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
Figure 34 : Expression des transporteurs ABC dans les lignées AGS et Kato III en présence d’épirubicine
RTqPCR réalisée après 48h de traitement par l’IC50 l’épirubicine (AGS: 0,15 µg/mL, Kato III: 0,10 µg/mL).
(Control : expression du gène considéré dans les cellules non traitées)
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 OXALIPLATINE 5-FU Ex pr es si on r el at iv e de l' A R N m control ABCB1 ABCG2 ABCC11 ABCC1 ABCC10 ABCC4 ABCC5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
control ABCB1 ABCG2 ABCC11 ABCC1 ABCC10 ABCC4 ABCC5
Ex pr es si on r el at iv e de l' A R N m AGS + EPIRUBICINE Kato III + EPIRUBICINE