Effet du pH sur l’activité protéolytique

La figure (10) ci-dessous, montre l’effet du pH sur l’activité protéolytique testée dans le milieu peptone de caséine; cette étude a été faite dans une gamme de pH de 5 à 10. D’après cette figure on remarque dans l’intervalle allant de 5 jusqu’à 7, une augmentation progressive de l’activité protéolytique avec l’augmentation du pH réactionnel ; une meilleure activité a été observée à pH 7 désignant le pH optimal de la protéase étudiée, Au delà de ce pH, on observe une diminution graduelle de l’activité protéolytique.

Figure 10 : Effet du pH sur l’activité protéolytique (milieu peptone de caséine).

0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 4 6 8 10 A ct iv it é p ro té o ly ti a u e (U I) pH

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2.3.2. Milieu son de blé

La figure (11) ci-dessous, montre l’effet du pH sur l’activité protéolytique testée dans le milieu son de blé; cette étude a été faite dans une gamme de pH de 5 à 10. D’après cette figure on remarque dans l’intervalle allant de 5 jusqu’à 7, une augmentation progressive de l’activité protéolytique avec l’augmentation du pH réactionnel ; une meilleure activité a été observée à pH 7 désignant le pH optimal de la protéase étudiée, Au delà de ce pH, on observe une diminution graduelle de l’activité protéolytique.

Figure 11 : Effet du pH sur l’activité protéolytique.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A ct iv it é p ro té o ly ti a u e (U I) pH

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2.4. Effet de la température 2.4.1. Milieu peptone de caséine

La figure 12 représente l’effet de la température sur l’activité protéolytique testée dans le milieu peptone de caséine ; elle montre une augmentation de l’activité protéolytique dans une gamme de température allant de 30°C jusqu’à 50°C. Une meilleure activité a été observée à une température 50°C. Après cette température, on observe une diminution de l’activité protéolytique.

Figure 12 : Effet de la température sur l’activité protéolytique.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 10 20 30 40 50 60 70 A ct iv it é p ro té o ly ti q u e (U I) Temperature (°C)

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2.4.2. Milieu son de blé

La figure 13 représente l’effet de la température sur l’activité protéolytique testée dans le milieu son de blé; elle montre une augmentation de l’activité protéolytique dans une gamme de température allant de 30°C jusqu’à 40°C. Une meilleure activité a été observée à une température 40°C. Après cette température, on observe une diminution de l’activité protéolytique.

Figure 13 : Effet de la température sur l’activité protéolytique.

3. Modélisation de la production de la protéase

L’activité protéolytique varie de 124 UI à 311,34 UI avec une moyenne de 233,28 UI (tableau 08). La plus faible activité correspond à l’essai N°4 où le pH du milieu est ajusté à 7, la concentration de son de blé est 3%. Par contre, l’activité la plus importante a été enregistrée dans l’essai N°3 où le pH est ajusté à 7, la concentration de son de blé est 6%.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 10 20 30 40 50 60 70 A ct iv it é p ro té o ly ti q u e (U I) Temperature (°C)

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Tableau 8 : Réponses (mg de tyrosine libéré/min/ml de solution enzymatique) obtenues pour les quatre essais.

La réponse moyenne (Yi) de l’expérimentation est donnée sous la forme :

Y= b

0

+ b

1

x

1

+ b

2

x

2

+……..b

k

x

k

Avec :

 b0 = Valeur moyenne de toutes les réponses = Σ Yi/N = 233.28

 Xi = Valeur de la variable explicative (valeur du facteur étudié)

 bi = Constante à calculer à partir des réponses en affectant chacune du signe (+ ou -) qui lui correspond dans la colonne du facteur pour lequel on veut calculer ce coefficient en faisant la somme algébrique et en divisant par le nombre d’expériences par exemple :

b3 = (-Y1 + Y2 + Y3 – Y4) /4 = 50.50

En appliquant la formule, nous avons obtenu les résultats suivants : b1 = 43.16

b2 = 15.61 b3= 50.50

Donc Y= 233.28 + 43.16 (température) + 15.61 (pH) + 50.50 (substrat)

Essai T (°C) pH Substrat Réponses (activité

protéolytique)

1 50 10 3 241,55

2 40 10 6 256,24

3 50 7 6 311.34

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Les protéases sont des enzymes essentielle dans les différentes applications industrielle, biotechnologique, médicinale et dans les domaines de recherche (Coral et al., 2003; Sandhya et al., 2005). Elles sont omniprésentes dans tous les organismes vivants vue leur rôle essentiel dans la croissance cellulaire et dans la différentiation (Gupta et al., 2002; Sandhya et al., 2005). Cependant, les protéases microbiennes sont plus intéressantes que celles provenant des sources végétales ou animales depuis qu’elles présentent les caractéristiques les plus recherchées dans les applications biotechnologiques.

Le présent travail porte sur la production de protéases par la souche fongique Metarhizium anisopliae et la caractérisation de l’enzyme qu’elle produit

Les différents résultats obtenus de la production protéolytique montrent que le maximum de la production d'enzyme a été observé après cinquième jour de la fermentation pour le milieu son de blé et après le huitième jour pour le milieu peptone de caséine. Le même temps est rapporté aussi bien pour la production de protéase par Metarhizium anisopliae (Prakash et Padmaja., 2012).

Durant les premières 24 h, l’activité est très faible, cela indique que les spores sont métaboliquement dormantes et que la dégradation du substrat ne peut s’installer qu’après la germination (Assamoi et al., 2009).

Une diminution progressive de l’activité protéolytique a été signalée avec l'augmentation du temps d'incubation, suggérant clairement le rôle d’enzyme en tant qu’un métabolite primaire, produit pendant la phase logarithmique de la croissance du champignon afin d'utiliser les nutriments (protéines) présents dans le substrat solide. L’incubation au-delà de cette période optimale a montré un déclin rapide dans le rendement d’enzyme. Cette diminution était probablement due à l'épuisement des éléments nutritifs, l’inactivation d’enzyme par d'autres métabolites toxiques libérés dans le milieu et les variations du pH de milieu (Sumantha et al., 2006 ; Paranthman et al., 2009).

La deuxième partie consistant à la détermination des conditions physicochimiques (pH et température) optimales de l’activité de l’enzyme produite par la souche Metarhizium anisopliae a montré que le pH optimal se situe à pH 7 pour les deux milieux, le même que celui rapporté par (Prakash et Padmaja., 2012). Ce résultat est très proche du pH optimal de la protéase neutre produite par plusieurs moisissures.

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Chaque enzyme possède un pH optimal auquel la vitesse de la réaction catalysée est maximale. Des légères variations du pH autour de cette valeur entraînent une diminution de l’activité enzymatique, en raison des modifications de l’ionisation des groupements compris dans le site actif de l’enzyme. Des déviations plus importantes du pH, conduisent à dénaturer l’enzyme en modifiant l’ionisation des acides aminés et en rompant les interactions non covalentes maintenant sa structure tridimensionnelle (Hames et al., 2006).

En ce qui concerne l’effet de température sur l’activité protéolytique, la température optimale est de 40°C pour le milieu son de blé et de 50°C pour la peptone de caséine, elle est similaire à celle obtenue par (Prakash et Padmaja., 2012). Par ailleurs, quelques protéases fongiques présentent des optima de température de 60°C (Singh et al., 1994; Chellappan et al., 2006).

Dans un autre volet, L’étude de l’effet de la concertation du son de blé pour la production de protéase par Metarhizium anisopliae a montré à une production maximale en activité enzymatique en présence de 3 % du son de blé. Par contre, une diminution de l’activité protéolytique, est observée dans les concentrations 2% 4% et 6%, ceci s’explique par une répression catabolique exercée par le glucose (Kole et al., 1988 ; Frankena et al., 1986 ; Gessesse et al., 2003 ; Patel et al., 2005).

Les résultats obtenus lors de notre travail affirment comme pour le cas de certains auteurs (Burges et Hussey, 1971 ; Pais, 1981 ; Vey, 1989) la production de la protéase par l’espèce Metarhizium anisopliae. Les résultats positifs de la production protéolytique sont influencés par différents facteurs (Température, pH et Substrat).

La plus grande réponse obtenue concerne l’essai (3) ou les facteurs choisis prennent les valeurs suivantes : température 50°C, pH =7 et le substrat 6%.

En comparant les résultats de l’essai 1, 2 et 4 avec ceux de 3 nous pouvons observer le rôle majeur joué par la température, le pH et la concentration du substrat car le changement de l’un d’eux fait basculer la réponse de l’activité enzymatique à son bas niveau, donc nous pouvons dire que ces trois facteurs sont des facteurs agiraient dans la production de la protéase comme cela a été noté par Prakash et Padmaja (2012).

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De manière générale, nous notons que les fermentations menées dans le but d’une production protéolytique exigent des plans d’expériences plus puissants statistiquement qui se basent sur un nombre de facteurs encore plus importants (tels que les sels), une souche génétiquement améliorée pour un rendement meilleur. Ces paramètres doivent être choisis de manière précoce et justifiable en fonction de la place systématique de la souche employée.

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Le but de ce travail est la production de la protéase neutre à partir Metarhizium anisopliae ainsi, de sélectionner les différents facteurs qui ont une influence sur la production de l’enzyme ciblée.

De façon globale, ce travail s’inscrit dans une approche qui consiste à l’exploitation des sous produits de blé et de peptone de caséine pour réduire l’utilisation des produits chimiques en favorisant l’émergence d’une nouvelle industrie de produits biologiques économiquement plus abordables.

Le dosage de l’activité protéolytique a montré que la peptone de caséine est un milieu favorable à la production des protéases par la souche Metarhizium anisopliae, en effet elle produit une activité importante en protéase neutre (620 UI).

Un prétraitement réalisé consiste à utiliser plusieurs concentrations du son de blé (2%, 3%, 4%, 5% et 6%) afin d’obtenir la meilleure production de la protéase neutre. L’activité protéolytique maximale (449 UI) est observée dans le flacon à 3 % de concentration du son de blé. Ce résultat montre que la concentration en son de blé présente une grande influence sur les performances du procédé.

L’étude cinétique ainsi que l’étude des propriétés physicochimiques de la protéase neutre produite par Metarhizium anisopliae a pour but d’établir les conditions et le mécanisme d’action de l’enzyme ce qui permet de montrer ses aptitudes technologiques. Le pH optimal de 7, la température optimale de 40°C pour le milieu son de blé et 50°C pour le milieu peptone de caséine, ces résultats indiquent que cette enzyme peut servir dans les applications technologiques telles que la boulangerie et biotechnologiques telles que la biologie moléculaire.

La principale étape sur laquelle devrait reposer l’amélioration de la sécrétion des protéases est l’optimisation du milieu de culture pour la fermentation. Pour cela, une matrice de Plackett-Burman a été employée afin d'accroître de façon substantielle l’activité protéolytique obtenue dans les milieux contenant que le son de blé en analysant l’effet d’un

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ensemble de facteurs (température, pH, substrat) sur la croissance fongique, production enzymatique et de protéines.

L’analyse statistique des résultats révèle que la production de la protéase est influencée par la présence des facteurs suivants : température, pH, substrat.

Par ailleurs, le plan du Plackett-Burman nous a permis de sélectionner la température, pH, substrat, comme facteurs favorisant la production de l’enzyme protéolytique.

Cependant, il reste plusieurs travaux à mener afin de répondre aux questions soulevées lors de cette étude et afin de poursuivre l’optimisation du procédé. Les recommandations pour des travaux ultérieurs sont les suivantes :

- Détermination des optima des facteurs sélectionnés suivant un autre plan statistique composite centré, du Box-Wilson par exemple.

- Il serait souhaitable d’entreprendre la caractérisation des protéases produites.

- Une étude d’extraction et de purification des protéases devra aussi être entreprise afin d’en vérifier la faisabilité.

-Pour une exploitation industrielle, il est nécessaire de réaliser des cinétiques en « Scall Up » (en fermenteur de 20 L, en fermenteur de 50 L et en fermenteur de 100 L), pour s’assurer de la stabilité de l’enzyme en conditions industrielles.

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Milieux de culture

 Lait gélosé

Le lait gélosé est un milieu utilisé pour la mise en évidence de l’activité protéolytique. La composition chimique de ce milieu en 950 d’eau distillé est

Lait………..………...10,5g Agar……….13,5g

pH = 7

 Sabouraud Peptone de caseine

La composition du milieu de fermentation par litre est :

Peptone de Caséine………..………20g Glucose……….10g pH = 6.8

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This work articulates himself around the production of fungal protease, an enzyme of industrial interest, to wit: Human and animal feeding, pharmaceutical and medical industry and on everything the industry of the detergents.

The study of the proteolytic activity produced on skim milk Agar that the strain Metarhizium anisopliae gave weak zones of hydrolysis in the first days, go in 4th and the 6th gave diameters varying between 22 and 30 mm. The production of proteases was realised on two different middles, the sound of wheat and the peptone of casein. The production of the enzyme is estimated by the measuring-out of the proteolytic activity. The results obtained revealed that the strain Metarhizium anisopliae, gave an excellent activity reaching 620UI tipped of the eighth day in fermentation for the middle peptone casein tipped and 411 UI of the fifth day for the middle sound of wheat. The proteolytic activity was studied concentration at different; 2% 3%; 4%; 5% and 3% the results gave one better activity 449 UI is produced in the middle at 6%.The study of the optima of pH and of temperature of incubation showed that protease produces by Metarhizium anisopliae Has optimum equal pH at 7 and one optimal temperature of 50°C for the middle peptone of casein and has optimum equal to 7 pH and an optimal temperature of 40°C argument for sound of wheat.

Experimental answer writes temperature, pH, and substrate with three mailmans selection under the shape of an equation of the first degree.

Page 46 نإ اذه لمعلا رودي لوح جاتنإ ميزنإ زايتوربلا ،يرطفلا و يذلا ربتعي ميزنإ وذ ةيمهأ ةيعانص ءاوس يف ةيذغت ناسنلإا و ناويحلا وأ يف ةعانصلا ةينلاديصلا و ةيبطلا و ةصاخ ةعانص تافظنملا .. طاشنلا ةسارد ترهظأ يميزنلاا " كيتيلويتورب " ةللاس نأ يزوليجلا بيلحلا طسو يف اهجتنت يتلا Metarhizium anisopliae نم حوارتت راطقأ تطعأ سداسلاو عبارلا نيب ،ىلولأا مايلأا يف ضفخنملا ينيتوربلا للحتلا قطانم ىطعأ 22 ىلإ 30 ا جاتنإ .ملم ميزنلإا جاتنإ ردقيو .نيزاكلا نوتببو حمقلا ةلاخن نيفلتخم نيطسو ىلع يرجأ زايتوربلا ميزن ةللاس نأ جئاتنلا تفشكو .يكيتيلويتورب طاشنلل ةرياعملاب Metarhizium anisopliae ىلإ لصوتلا زاتمم طاشن يطعي 620 UI تطعأو نيزاكلا نوتبب طسولل رمختلل نماثلا مويلا ةياهن يف 411 UI .حمقلا ةلاخن طسولل سماخلا مويلا ةياهن يف مت ت حمقلا ةلاخن نم ةفلتخم تازيكرتب يكيتيلويتورب طاشنلا ةسارد 2 ،% 3 ،% 4 ،% 5 و % 6 يف لضفأ جئاتن ىطعأو % زيكرتلا وذ طسولا 3 % ( 449 UI ) امك . نأ ةسارد ةجرد ةضومحلا ةجردو ةرارحلا نيتبسانملا نضحلل ترهظأ نأ ميزنإ زايتوربلا جتني نم فرط Metarhizium anisopliae نم ىلثم ةضومح ةجرد يف 7 نم ىوصق ةرارح ةجردو 50 نم ىلثم ةضومح ةجردو نيزاكلا نوتبب طسولا يف ةيوئم ةجرد 7 ةرارح ةجرد ىصقأو 40 حمقلا هلاخنل ةيوئم ةجرد . ثلاث رايتخاب ىلولأا ةجردلا نم ةلداعم لكش يف بوتكم يبيرجتلا درلا ةضومحلا ةجردو ةرارحلا ةجرد يه و لماوع ة ةيساسلاا ةداملاو . تاملكلا ةيحاتفملا : ،زايتورب Metarhizium anisopliae

،

طاشن

يميزنإ

"

protéolytique " ، مخت .ر

Année universitaire: 2015/2016 ^{Présenté par: LOUDJANI Houyem}

BELMERABET Kamilia

Thème:

Etude des paramètres physiquo-chimiques de la production de protéase par le

champignon entomopathogene Metarhizium anisopliae.

Résumé:

Ce travail s’articule autour de la production d’une protése fongique, une enzyme d’intérêt industriel, à savoir : alimentation humaine et animale, industrie pharmaceutique et médicale et sur tout l’industrie des détergents.

Dans le document Mémoire présenté (Page 39-58)