c) Des effets angiogènes qui diffèrent selon l’origine vasculaire
E. Rôle d’EG-VEGF sur les trophoblastes extravilleux (TEV)
I. Effet d’EG-VEGF sur l’angiogenèse placentaire (première publication)
1.1 Contexte de la première publication
Quand j’ai débuté mon travail de thèse, le rôle angiogène d’EG-VEGF était relativement bien établi dans différents organes dérivés des glandes endocrines, comme les testicules (LeCouter et al. 2003b, Samson et al. 2004), les ovaires (Kisliouk et al. 2005a, Kisliouk et al. 2005b, LeCouter et al. 2001), et les surrénales (LeCouter et al. 2001, Lin D. C. et al. 2002a). Le rôle angiogène d’EG-VEGF dans des tissus non endocrines, comme dans la choroïde par exemple, avait également été rapporté (Tanaka et al. 2006). En 2001, l’équipe de Ferrara rapportait qu’EG-VEGF n’activait pas la prolifération et la migration des HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), cellules endothéliales dérivées de la veine ombilicale humaine (LeCouter et al. 2001), mais aucune donnée sur le potentiel angiogène d’EG-VEGF sur les cellules endothéliales placentaires, qui est un organe privilégié de l’expression de ce facteur, n’avait été publiée jusque là.
Devant ce constat, nous avons entrepris d’établir le rôle angiogène d’EG-VEGF sur les cellules endothéliales placentaires, les HPEC. De nombreuses données suggéraient une action potentielle d’EG-VEGF sur l’angiogenèse du placenta :
- EG-VEGF a un rôle angiogène dans de nombreux organes.
- Le placenta, organe fortement vascularisé, est un site d’expression privilégié de ce facteur angiogène et de ses récepteurs.
- L’expression sérique d’EG-VEGF est maximale au 1er trimestre de grossesse (Hoffmann et al. 2009), période où l’angiogenèse placentaire est fortement activée. - L’hypoxie augmente l’expression d’EG-VEGF et de son récepteur PROKR1 dans les
trophoblastes (Hoffmann et al. 2006).
- EG-VEGF et VEGF sont exprimés dans des compartiments cellulaires adjacents dans le placenta, suggérant une complémentarité d’action de ces deux facteurs (voir figure 52).
Figure 53 : Morphologie de cellules endothéliales HUVEC et HPEC. Les HUVEC (à gauche) sont polygonales alors que les HPEC (à droite) sont allongées, forme qu’elles conservent même à confluence.
Figure 54 : Localisation des HPEC et des HUVEC. Schémas adaptés de
http://static.howstuffworks.com/gif/adam/images/en/anatomy-of-a-normal-placenta-picture.jpg, http://www.bioscience.org/atlases/fert/images/figures/matuplac.jpg et (Fournier et al. 2007)
Des précautions particulières étaient nécessaires pour étudier l’effet angiogène d’EG-VEGF dans la villosité placentaire. En effet, l’hétérogénéité des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires est bien établie, tant au niveau de leur morphologie que de leur fonctionnalité (voir figure 53) (Bicknell 1993, Fajardo 1989, Garlanda and Dejana 1997, Zetter 1981).
De nombreuses caractéristiques discriminantes ont été rapportées pour les HUVEC et les HPEC concernant : leur morphologie (Jinga et al. 2000), leur expression génique (Murthi et al. 2007, Murthi et al. 2008), leur sécrétion de substances vasoactives (Lang et al. 2003), et leur réponse proliférative à des agents mitogènes comme le VEGF, PlGF ou FGF-2 (Khaliq et al. 1999, Lang et al. 2001, Lang et al. 2003, Migdal et al. 1998, Park et al. 1994). Cette hétérogénéité entre les cellules macrovasculaires et microvasculaires impose d’étudier spécifiquement les cellules endothéliales de l’organe concerné, et d’éviter au maximum les extrapolations d’organe à organe. Les HUVEC, largement utilisées pour l’étude des processus angiogènes, ne permettent donc pas de conclure sur les caractéristiques des cellules endothéliales dérivées d’organes différents (voir figure 54) (Lang et al. 2001). De ce fait, l’absence d’effets d’EG-VEGF sur la prolifération et la migration des HUVEC (LeCouter et al. 2001) n’excluait pas une possible action de cette cytokine sur les HPEC.
Pour étudier l’effet angiogène d’EG-VEGF sur le placenta, nous avons donc choisi d’utiliser les cellules endothéliales placentaires HPEC. Le placenta, qui possède à terme un réseau vasculaire estimé à 550 km environ (Burton and Jauniaux 1995, Jackson et al. 1992), est une excellente source pour les cellules endothéliales microvasculaires. Pour notre étude, l’isolement d’HPEC à partir de vaisseaux de placentas à terme a été réalisé selon la technique décrite par l’équipe de Simionescu (Jinga et al. 2000). Après 10-12 jours de culture, les HPEC arrivent à confluence et possèdent un phénotype allongé caractéristique. Après vérification du phénotype endothélial de nos cellules par différents marqueurs endothéliaux (CD-31, facteur de von Willebrand, UEA-lectine, ou internalisation de LDL acétylées), notre travail a consisté à établir l’action angiogène d’EG-VEGF sur les cellules endothéliales microvasculaires placentaires HPEC, et à la comparer à celle sur les cellules macrovasculaires ombilicales HUVEC.
Figure 55 : Test de formation de réseaux pseudo-vasculaires. Les cellules endothéliales forment spontanément des réseaux pseudo-vasculaires lorsqu’elles sont cultivées sur Matrigel® (Murray 2003). La
présence de certains facteurs dans le milieu de culture peut augmenter ou diminuer le nombre de réseaux à un moment donné.
Figure 56 : Test de bourgeonnement de sphéroïdes. Les cellules endothéliales sont mises en culture dans des puits à fond rond sur la nuit, permettant ainsi la formation d’un sphéroïde par puits. Le lendemain, le
sphéroïde est transféré avec précaution, et inclus dans un gel de collagène. Les premiers bourgeons apparaissent dès les premières heures d’inclusion.
Dans un premier temps, nous avons étudié l’expression des récepteurs d’EG-VEGF, PROKR1 et PROKR2, dans les vaisseaux fœtaux placentaires et ombilicaux, puis nous avons vérifié le maintien de l’expression de ces récepteurs après l’isolement et la culture des HPEC et des HUVEC. Nous avons ensuite étudié l’effet d’EG-VEGF sur la prolifération, la migration et la survie des HPEC et des HUVEC.
Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet angiogène d’EG-VEGF par deux tests complémentaires : le test d’organisation en réseaux pseudo-vasculaires (voir figure 55) et le bourgeonnement de sphéroïdes d’HPEC et d’HUVEC (voir figure 56).
Dans le placenta, l’endothélium microvasculaire participe non seulement à l’angiogenèse, mais également aux échanges de nutriments et de solutés entre la mère et le fœtus. Il constitue donc une véritable barrière semi-perméable essentielle pour le succès de la grossesse. Dans une troisième partie, nous avons déterminé l’effet d’EG-VEGF sur la perméabilité endothéliale et le transport para-cellulaire d’une monocouche d’HPEC.
Grâce à une stratégie d’ARN interférents et d’anticorps bloquants, nous avons étudié l’implication différentielle des récepteurs PROKR1 et PROKR2 dans l’effet d’EG-VEGF sur l’angiogenèse et la perméabilité des HPEC.
Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2832–2843, August 15, 2010