VI. Hypothèses sur la formation de l’adduit glutathion-cyanidine
VI.2. Addition nucléophile
VI.2.1. Effet de la cystéine sur la transformation enzymatique de la (+)-catéchine
puisse imaginer pour une comparaison avec le GSH, puisqu'il s'agit du résidu central du tripeptide. Si un adduit covalent cystéine-cyanidine de même nature que l'adduit glutathion-cyanidine que nous avons observé pouvait se former en présence d'enzyme, la structure neutre aurait une masse moléculaire de 407 Da (M+1, m/z 408).
L’effet de la cystéine sur la transformation enzymatique de la (+)-catéchine a été d’abord testé en utilisant l’holoenzyme en présence de sel de Fe(II). Comme le montre la figure 118a, cinq pics sont observés. Le pic 1 (8,7 min) est la (+)-catéchine résiduelle (pic 1’, 8,6 min, figure 118b), et les quatre autres pics sont de nouveaux produits qui sont inconnus.
De plus, la concentration de (+)-catéchine résiduelle est plus élevée qu'en l'absence de cystéine, et l'adduit ascorbate-cyanidine n'est plus observé.
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Figure 118. Analyse chromatographique de l'effet de la cystéine sur la transformation enzymatique de la (+)-catéchine en présence de sel de Fe(II).
Chromatogrammes HPLC sur colonne Atlantis C18. Le milieu réactionnel contient 10-6 M de VvANS (holoenzyme), 10 µM de sel de Fe(II) et une concentration initiale de 100 µM de (+)-catéchine, dans le tampon acétate d'ammonium 20 mM, pH 6,5 et 35°C. (a) En présence de cystéine 1 mM; (b) En l'absence de cystéine, en bleu.
Figure 119. Analyse MS et MS/MS du produit induit par la présence de cystéine et dont le temps de rétention est proche de celui de la (+)-catéchine.
(a) Analyse MS du mélange de (+)-catéchine résiduelle et de produit élué à 8,9 min; (b) Analyse MS/MS de l’ion de m/z 562 correspondant à l’ion [M+H]+ de ce produit.
Le produit élué à 8,9 min (pic 2, figure 118) étant très proche de la (+)-catéchine résiduelle, les deux composés ont été collectés ensemble. L’analyse MS de l’échantillon collecté montre deux grands pics de m/z 291 et 562 (figure 119a). L’ion de m/z 291 est l’ion [M+H]+ de la (+)-catéchine, et l’ion de m/z 562 est l’ion [M+H]+ du produit élué à 8,9 min. La fragmentation MS/MS de cet ion [M+H]+ de m/z 562 produit plusieurs ions fragments (figure 119b), mais nous n'avons pas pu interpréter ces données.
Comme le montre la figure 120, l’analyse MS du produit élué à 11,2 min (pic 3, figure 118) montre un seul grand pic de m/z 374 (figure 120a), qui est l’ion [M+H]+ correspondant. La fragmentation MS/MS de cet ion de m/z 374 produit plusieurs ions fragments (figure 120b) qui n'ont pas pu être interprétés.
Figure 120. Analyse MS et MS/MS du produit induit par la présence de cystéine et dont le temps de rétention est de l'ordre de 11,2 min.
(a) Analyse MS; (b) Analyse MS/MS de l'ion de m/z 374.
Comme le montre la figure 121, l'analyse MS du produit élué à 14,6 min (pic 4, figure 118) montre deux ions majeurs de m/z 344 et 388 (figure 121a) dont l'assignation est incertaine. Comme le montre l'analyse MS/MS de la figure 121b, l’ion de m/z 344 ne donne qu'un ion fragment de m/z 234 dont l’intensité est assez forte. L’ion de m/z 388 donne quant à lui trois ions fragments majeurs de m/z 149, 342 et 370, et un ion fragment mineur de m/z 234 dont l’intensité de signal est la plus
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faible (figure 121c). Ces résultats suggèrent que les ions de m/z 344 et 388 correspondent à deux produits différents qui ne sont pas séparés sur la colonne Atlantis C18 (pic 4, figure 118).
Figure 121. Analyse MS et MS/MS du produit induit par la présence de cystéine et dont le temps de rétention est de l'ordre de 14,6 min.
(a) Analyse MS; (b) Analyse MS/MS de l’ion de m/z 344; (c) Analyse MS/MS de l’ion de m/z 388. Comme le montre la figure 122, l'analyse MS du produit élué à 17,4 min (pic 5, figure 118) montre un grand pic de m/z 388 qui doit être l’ion [M+H]+ correspondant (figure 122a). La fragmentation MS/MS de cet ion produit plusieurs ions fragments (figure 122b).
Notons qu’un ion de m/z 388 a été déjà observé lors de l’analyse MS du produit élué à 14,6 min (figure 121a). Cependant, nous pensons que ces deux ions de m/z 388 proviennent de deux produits
différents ayant la même masse moléculaire, parce que, comme le montre dans les figures 121c et
122b, tous les autres ions fragments majeurs de ces deux ions de m/z 388 sont différents, à
l'exception des ions fragments de m/z 149 et 342.
Figure 122. Analyse MS et MS/MS du produit induit par la présence de cystéine et dont le temps de rétention est de l'ordre de 17,4 min.
(a) Analyse MS; (b) Analyse MS/MS de l'ion de m/z 388.
Ces résultats indiquent que la cystéine modifie complètement le mode de transformation enzymatique de la (+)-catéchine, car aucun des produits obtenus lors de la réaction réalisée en l’absence de cystéine (figure 118b, en bleu) n'est plus observé. Il est par ailleurs certain qu’aucun adduit thioéther n'est observé, même si les quatre nouveaux produits (pics 2-5) n'ont pas pu être identifiés par MS et MS/MS.
Afin de savoir si l'effet particulier de la cystéine pourrait être dû à son interaction avec le sel de Fe(II), nous avons testé son effet sur le complexe VvANS en l'absence de sel de Fe(II).
La production du complexe de VvANS-Fe(II) (≈ 10-6 M) a été réalisée dans le tampon acétate d’ammonium 20 mM, pH 6,3, comme pour le complexe préparé en présence de GSH, mais cette fois-ci en présence de 0,2 mM de cystéine (Matériels et Méthodes, IV.1.2). La réaction est déclenchée par l'addition de 125 µl de solution mère de (+)-catéchine (2 mM dans le méthanol) puis
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l'analyse de spectrométrie de masse en flux continu est réalisée à 24°C en suivant exactement la même procédure que lors de l'analyse des effets du GSH.
Comme le montre la figure 123, la diminution de la (+)-catéchine (M+1, m/z 291) est observée pendant 50 min, ainsi que la formation correspondante des deux produits ayant respectivement une masse moléculaire de 343 Da (M+1, m/z 344) et 387 Da (M+1, m/z 388). Le produit élué à 11,2 min (pic 3, figure 118) ayant une masse moléculaire de 373 Da (M+1, m/z 374) est observé immédiatement, et aucun changement d'intensité du signal correspondant n'est plus observé pendant les 50 min suivantes, ce qui suggère qu'il s'agit d'un produit trop précoce pour être visualisé en HPLC, mais très stable.
Figure 123. Monitorage par spectrométrie de masse en temps réel de la transformation de la (+)-catéchine par le complexe VvANS-Fe(II) en présence de cystéine.
Le produit élué à 8,9 min (pic 2, figure 118) ayant une masse moléculaire de 561 Da (M+1, m/z 562) a quant à lui disparu en l’absence de sels de Fe(II). Comparé à la réaction analysée en l'absence de mercaptan (figure 109), les intermédiaire d’oxydation à un électron (M+1, m/z 290), deux électrons (M+1, m/z 289), trois électrons (M+1, m/z 288) et quatre électrons (M+1, m/z 287) issus de la (+)-catéchine sont retrouvés, mais il semble que l’intermédiaire d’oxydation à deux électrons soit beaucoup plus stable en présence de cystéine, et que les intermédiaires d’oxydation à trois et à quatre électrons soient au contraire moins stables en présence de cystéine. Ces deux derniers intermédiaires diminuent en effet au lieu d'augmenter comme en l’absence de cystéine. Enfin, une oxydation de cystéine en cystine (M+1, m/z 241) a été observée.
Pour confirmer la disparition du produit normalement élué à 8,9 min (pic 2, figure 118) que nous avons découverte par spectrométrie de masse en temps réel, la transformation de la (+)-catéchine par le complexe VvANS-Fe(II) a été refaite en présence de cystéine 0,2 mM, de manière à vérifier ce qu'il en est en HPLC.
Comme le montre la figure 124, nous pouvons confirmer que le produit élué à 8,9 min a bien disparu en l’absence de Fe(II), et que les trois autres produits sont bien observés. Il n'y a donc bien aucune production de thioéther en présence de cystéine.
On notera par ailleurs que cette expérience de contrôle nous confirme au passage que le monitorage par spectrométrie de masse en temps réel est fiable.
Figure 124. Analyse chromatographique de l'effet de la cystéine sur la transformation de la (+)-catéchine par le complexe VvANS-Fe(II).
Chromatogramme HPLC sur colonne Atlantis C18. Le milieu réactionnel contient 10-6 M de complexe VvANS-Fe(II), 0,2 mM de cystéine et une concentration initiale de 100 µM de (+)-catéchine, dans le tampon acétate d'ammonium 20 mM, pH 6,5 et 35°C.
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