2.3.2.1.1 Effet cluster glycoside - : DENDRIMERES ET THERAPIES ANTI-VIH

CHAPITRE I : DENDRIMERES ET THERAPIES ANTI-VIH

I. 2.3.2.1.1 Effet cluster glycoside

I.2.3.2.2 Biocompatibilité ...38

I.2.3.2.2.1 Cytotoxicité in vitro...39 I.2.3.2.2.2 Cytotoxicité in vivo ...40 I.2.3.2.2.3 Immunogénicité ...42 I.2.3.2.2.4 Biopermabilité...42

I.2.3.3 Inhibiteurs dendrimériques de reconnaissance et/ou fixation ...42

I.2.3.3.1 Inhibiteurs de l’entrée du VIH dans les cellules hôtes...43

I.2.3.3.1.1 Interaction non spécifique de type électrostatique avec le VIH...43 I.2.3.3.1.2 Interaction spécifique avec le VIH...50 I.2.3.3.1.3 Interaction spécifique avec la cellule cible du VIH...59

I.2.3.3.2 Inhibiteur de fusion ...68 I.2.3.4 Inhibiteurs du cycle de réplication...69

I.2.3.4.1.2 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse...70 I.2.3.4.1.3 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse...71 I.2.3.4.1.4 Dendrimères comme pro-médicaments inhibiteurs de la transcriptase inverse...72 I.2.3.4.1.5 Vectorisation des inhibiteurs de la transcriptase inverse par les dendrimères...74 I.2.3.4.1.6 Dendrimères inhibiteurs de la transcriptase inverse...80

I.2.3.4.2 Inhibiteurs de l’intégrase ...80 I.2.3.4.3 Inhibiteurs de la transcription ...81 I.2.3.4.4 Inhibiteurs de la protéase...83 I.2.3.5 Thérapie génique anti-VIH...86

I.3CONCLUSION ET BUT DE CETTE THESE...87 I.4BIBLIOGRAPHIE...90

I.1 Introduction

Le VIH s’attache à la surface de la cellule hôte (adhésion), puis il pénètre dans la cellule qu’il utilise pour la réplication de son ADN et la synthèse de ses protéines. Une façon de stopper l’infection consiste à bloquer un de ces processus.

Les stratégies antivirales sont généralement dirigées vers: (1) le mécanisme d’interaction entre le virus et leurs cellules cibles, (2) le cycle de réplication et (3) la désactivation de gènes du virus.

Parmi les nouvelles molécules en cours de développement, les dendrimères, 10 à 100 fois plus petits que la plupart des virus, peuvent être conçus pour interférer dans les processus d’adhésion virus-cellule hôte et inhiber l’infection dans l’étape d’entrée virale. Dans ce cas, trois mécanismes d’action sont mis en jeu : (1) le dendrimère interagit avec le virus de manière non spécifique, (2) le dendrimère s’attache spécifiquement à des composants viraux et, (3) le dendrimère s’attache aux récepteurs cellulaires spécifiques.

D’autres stratégies antivirales emploient les dendrimères en tant qu’inhibiteurs d’enzymes virales et visent directement les étapes du cycle de réplication. Dans ce cas, les dendrimères sont utilisés comme agents de transport, soit avec le principe actif attaché à lui (promédicament), soit en encapsulant le principe actif à leur intérieur. Cette utilisation du dendrimère améliore l’efficacité et diminue la toxicité du principe actif. Enfin, il existe d’autres approches thérapeutiques qui utilisent les dendrimères pour la thérapie génique.(1-4)

I.2 Thérapie anti-VIH

I.2.1 Le SIDA

Le SIDA (Syndrome de l’ImmunoDéficience Acquise) est une maladie infectieuse, virale et chronique caractérisée par la diminution des moyens de défense de l’organisme. Cela entraîne l’apparition de maladies opportunistes qui sont appelées ainsi car elles se développent en profitant de l’incapacité du système immunitaire d’une personne malade à se défendre. Ces maladies sont généralement infectieuses ou cancéreuses, elles affaibliront encore plus l’organisme atteint.

En 1983, F. Barré-Sinoussi et L. Montagnier,(5) découvrent et isolent l’agent responsable de cette maladie : le VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine). Ce virus attaque principalement les cellules T CD4(+) (les lymphocytes T4 et les macrophages) du système immunitaire humain et l’affaiblit en quelques années. Il est transmis par plusieurs fluides corporels : le sang, les sécrétions vaginales, le sperme ou le lait maternel.(6)_{Le SIDA est aujourd’hui considéré comme une pandémie.}

Depuis le début de l’épidémie,(7)_{près de 60 millions de personnes ont été infectées par le VIH}

et 25 millions de personnes sont décédées de causes liées au VIH.

En 2008, on dénombre 33,4 millions de personnes vivant avec le VIH, 2,7 millions de nouvelles infections et 2 millions de décès liés au SIDA. Environ 430.000 enfants sont nés avec le VIH, ce qui porte à 2,1 millions le nombre total d’enfants de moins de 15 ans vivant avec le VIH.

Les jeunes représentent environ 40% de l’ensemble des infections par le VIH dans le monde. L’Afrique subsaharienne est la région la plus touchée et abrite 67% de l’ensemble des personnes vivant avec le VIH dans le monde et 91% du total des nouvelles infections chez l’enfant. Le nombre de nouvelles infections par le VIH continue à devancer le nombre de personnes sous traitement. Pour deux personnes entamant un traitement, cinq sont infectées par le virus.

Figure I.2 Nombre estimé des nouvelles infections chez les adultes et chez les enfants par le VIH, 2008 (www.unaids.org) Europe de l’Ouest et Centrale 30 000 30 000 [23 000 [23 000 ––35 000]35 000] Afrique du Nord et Moyen-Orient 35 000 35 000 [24 000 [24 000 ––46 000]46 000] Afrique Subsaharienne 1.9 million 1.9 million [1.6 [1.6 ––2.2 millions]2.2 millions] Eastern Europe & Central Asia

110 000 110 000 [100 000 [100 000 ––130 000]130 000]

Asie du Sud et Sud-Est

280 000 280 000 [240 000 [240 000 ––320 000]320 000] Océanie 3900 3900 [2900 [2900 ––5100]5100] Amérique du Nord 55 000 [36 000 – 61 000] Amérique latine 170 000 170 000 [150 000 [150 000 ––200 000]200 000] Asie de l’Est 75 000 75 000 [58 000 [58 000 ––88 000]88 000] Caraïbe 20 000 [16 000 – 24 000]

Total: 2.7 millions (2.4 – 3.0 millions)

Europe de l’Ouest et Centrale 30 000 30 000 [23 000 [23 000 ––35 000]35 000] Afrique du Nord et Moyen-Orient 35 000 35 000 [24 000 [24 000 ––46 000]46 000] Afrique Subsaharienne 1.9 million 1.9 million [1.6 [1.6 ––2.2 millions]2.2 millions] Eastern Europe & Central Asia

110 000 110 000 [100 000 [100 000 ––130 000]130 000]

Asie du Sud et Sud-Est

Actuellement, aucun vaccin n’est disponible pour se protéger du VIH. Bien qu’ayant une certaine efficacité, les traitements antiviraux employés ne permettent que de ralentir la prolifération du virus.

I.2.2 Le virus d’Immunodéficience Humaine (VIH)

Le VIH est un rétrovirus à ARN de la famille Retroviridae, genre lentivirus qui se caractérise par une longue période d’incubation et donc par une évolution lente de la maladie.

Il existe deux espèces de VIH: le VIH-1 et le VIH-2. Le VIH-2, également isolé par le groupe du Professeur Montagnier en 1986, a seulement 40% d’homologie avec le VIH-1 en se différenciant surtout par son enveloppe externe. Il est plus proche du virus de l’immunodéficience du singe (VIS) que du VIH-1.(8) Il est principalement localisé en Afrique de l’Ouest.

D’autre part, les souches de type VIH-1 sont classées en deux grands groupes : M et O. Le groupes M est divisé à la fois en 9 sous-types qui peuvent être corrélés à des zones géographiques : A, B, C, D, E, F, G, H et NT (Figure I.3). Cette variabilité énorme du VIH-1 est due au manque de fidélité de la transcriptase inverse. Elle produit des erreurs pour chaque 2000-5000 nucléotides polymérisés.(9) La plupart des mutations se produisent dans la région C2-V3 de la glycoprotéine virale et dans les protéines de la capside. De plus, le taux de réplication du virus est d’environ 1010 particules virales par jour.(10, 11)_{Pour ces raisons, la transcriptase inverse (TI) est une des principales}

I.2.2.1 La structure du VIH-1

Pour envisager et développer des stratégies thérapeutiques, il est nécessaire tout d’abord de comprendre la complexité structurale du VIH et sa pathogenèse. Gelderblom et al. ont été les premiers à établir la morphologie et la structure du VIH-1 par microscopie électronique (Figure I.4).(12) intégrase protéase transcriptase inverse gp120 gp41 nucléocapside ARN génome enveloppe

Figure I.4 Structure du VIH

Le virus mature du VIH-1 a un aspect sphérique d’un diamètre d’environ 90 à 120 nm. Il comporte une enveloppe membranaire composée des restes de la membrane cytoplasmique de la cellule infectée. Cette enveloppe est recouverte de deux types de glycoprotéines : la gp41 ou glycoprotéine transmembranaire (partie interne) et la gp120 (partie externe). La protéine gp41 est liée de façon non-covalente à la glycoprotéine gp120 extérieure.(12)_{Le complexe gp120/gp41 apparait à}

la surface comme un hétérotrimère. La gp120 et la gp41 sont des cibles importantes pour les stratégies thérapeutiques. En effet, la gp120 participe à la reconnaissance et à l’ancrage du virus dans la cellule hôte et la gp41 a un rôle clef dans le processus de fusion entre le virus et les cellules cibles.(13)

A l’intérieur de l’enveloppe se trouve une matrice composée de protéines p17, et la capside virale qui est composée par des protéines p24. La nucléocapside en forme de cône tronqué est formée, quant à elle, de protéines p6 et p7.

Finalement, le génome du VIH contenu dans la nucléocapside est constitué d’un simple brin d’ARN en double exemplaire, accompagné d’enzymes qui :

- transcrivent l’ARN viral en ADN viral (transcriptase inverse, TI) - intègrent l’ADN viral à l’ADN cellulaire (intégrase, IN)

- participent à l’assemblage du virus (protéase, PR).

Ces trois enzymes sont des cibles potentielles pour la chimiothérapie antirétrovirale.

Le génome viral est composé de neuf gènes. Les trois principaux sont des gènes structurels communs à tous les rétrovirus : gag (code pour les protéines structurales de la matrice, de la capside, de la nucléocapside), pol (pour POLymérase, code pour les enzymes virales : la transcriptase inverse, l’intégrase et la protéase) et env (pour ENVeloppe, code pour les protéines d’enveloppe, les glycoprotéines transmembranaires et de surface). Ces gènes produisent des précurseurs sous la forme de poly-protéines qui deviennent fonctionnelles grâce à l’action de la protéase.(14, 15) Les six autres gènes sont tat, rev, nef, vif, vpr et vpu, qui codent des protéines régulatrices.

I.2.2.2 Cycle de réplication du VIH

Le VIH a besoin de pénétrer la cellule hôte pour pouvoir se répliquer. Le mécanisme de réplication du VIH peut être résumé en six étapes principales (Figure I.5). Chaque étape constitue donc une cible potentielle pour développer des stratégies thérapeutiques.

1 2 3 4 5 6 7 8 Récepteur viral gp120 Récepteur cellulaire CD4 ou GalCer Cellule humaine

1. L’entrée virale

L’entrée virale est un processus complexe qui se déroule en plusieurs sous-étapes : (1) la fixation de la gp120 au récepteur CD4, (2) l’interaction des corécepteurs et (3) la fusion (Figure I.6).

CD4 ou GalCer CCR5 CXCR4 Cellule gp41 gp120 Boucles variables de la gp120 nucléocapside VIH 1 2 3

(1) Fixation de la gp120 au récepteur CD4. (2) Fixation d'une boucle variable de la gp120 au corécepteur et fixation de la gp41 sur la membrane cellulaire. (3) Pénétration dans la cellule

Figure I.6 Processus d'attachement du VIH

Le VIH-1 cible particulièrement les lymphocytes T CD4(+), les macrophages et des cellules du système nerveux (les cellules dendritiques et les cellules microgliales cérébrales).(16)_{Ainsi, la}

réplication virale a lieu dans plusieurs tissus.

Cette étape repose sur une reconnaissance entre la glycoprotéine de surface virale, gp120, et les récepteurs présents sur la cellule cible.(17)

Les récepteurs et corécepteurs cellulaires les plus courants sont :

(1) le CD4, présent sur la membrane cellulaire des lymphocytes T4 et des macrophages.(16)_Le

CD4 interagit tout d’abord avec la gp120 où la boucle V3 a un rôle clef dans ce processus de reconnaissance.(18)

(2) des récepteurs de chimiokine, le CXCR4 et le CCR5, qui favorisent l’entrée du VIH-1 dans les lymphocytes, les monocytes et les macrophages.(19) Ces corécepteurs vont également interagir avec la gp120 au niveau de la boucle V3 afin de renforcer l’interaction virus-cellule après fixation de la gp120 sur le CD4.

(3) le galactosylcéramide (GalCer), présent à la surface des cellules nerveuses, des cellules épithéliales du colon et des fibroblastes.(20)_{Ce récepteur glycosphingolipidique a aussi une affinité}

très prononcée pour la boucle V3 de la gp120.(21)

La stratégie antivirale développée dans ces travaux de thèse repose sur la conception d’analogues synthétiques du GalCer. En effet, ces analogues vont reconnaître et saturer la boucle V3 de la gp120. En conséquence, la boucle V3 ainsi bloquée ne peut pas interagir avec le récepteur cellulaire GalCer ni avec le récepteur CD4. De cette façon, cette stratégie permet de stopper l’infection par le VIH sur des cellules GalCer(+) et CD4(+) (Figure I.7).

Analogues solubles du GalCer Reconnaissance = infection Pas de reconnaissance = Pas d’infection

Figure I.7 Stratégie anti-VIH en employant des analogues solubles du GalCer

Après l’union avec un récepteur viral, la gp120 change de conformation et est attirée vers un corécepteur. Cette union libère la glycoprotéine gp41 qui se fixe sur la membrane plasmique. Puis la gp41 se replie sur elle-même et attire l’enveloppe virale vers la membrane plasmique en provoquant la fusion entre la membrane virale et la membrane cellulaire grâce à un peptide de fusion présent

2. Rétrotranscription

Cette étape est spécifique aux rétrovirus qui ont pour génome l'ARN. L’ARN viral doit donc être converti en ADN viral car seul l'ADN peut être intégré dans le génome de la cellule cible. Cette opération est réalisée par la transcriptase inverse (TI). Puis la TI synthétise le second brin d'ADN, le brin(+), en utilisant l'ADN brin(-) comme matrice. L'ADN final est une molécule bicaténaire aussi dénommée ADN à double-brins.

3. Intégration

À ce moment du cycle, l'ADN double-brins forme un complexe de pré-intégration avec l'intégrase et d’autres composants protéiques viraux et cellulaires. Ce complexe interagit avec la membrane nucléaire, pour la traverser et accéder à la chromatine cellulaire. L'ADN s'intègre ensuite au hasard dans le génome de la cellule cible grâce à l’action de l’intégrase.

4. Transcription

L’ARN polymérase écarte localement les deux brins d'ADN de la cellule. L’ARNm (messager) est ensuite synthétisé sous forme d’une chaîne monobrin par la polymérisation des bases azotées libres du noyau qui viennent former la séquence complémentaire. Cet ARNm est hétérogène puisqu’il est constitué d’une succession d’introns (parties non codantes) et d’exons (partie codantes). Cet ARNm doit donc subir une maturation pour pouvoir être lu par les ribosomes. Les introns sont donc éliminés par excision pour ne laisser que les exons.

5. Traduction

L’ARNm sort du noyau par les pores nucléaires puis est lu par les ribosomes du réticulum endoplasmique rugueux. Pour cela, il se glisse entre les deux sous-unités du ribosome. Le ribosome attribue un acide aminé à chaque codon (groupe de trois nucléotides) de l’ARNm. De cette façon a lieu la synthèse des éléments viraux comme les poly-protéines gag, gag-pol et env et les protéines fonctionnelles tat, nef et rev. Ces polypeptides ainsi formés ne sont pas encore opérationnels. Ils doivent subir une maturation dans l’appareil de Golgi.

6, 7, 8. Assemblage, maturation et bourgeonnement

Lorsque les poly-protéines sortent de l’appareil de Golgi, l’ARN viral et les protéines virales gag et gag-pol sont assemblés dans des particules virales immatures au niveau de la membrane cellulaire et partiellement libérés par bourgeonnement. Ces particules vont subir un processus de maturation et vont devenir infectieuses grâce à l’action de la protéase. Elle doit couper les liens qui unissent les différentes protéines de structure gag et gag-pol qui elles-mêmes vont être transformées dans la matrice, la capside et la nucléocapside.

La maturation se produit durant l’assemblage des composants viraux à la surface de la membrane cellulaire humaine et/ou après le bourgeonnement des particules virales dans le milieu extracellulaire.

D’autre part, il existe un autre processus associé au VIH qui permet la propagation de l’infection de cellule à cellule. En effet, les cellules humaines infectées par le VIH expriment les glycoprotéines virales à leur surface. En conséquence, ces cellules ont de l’affinité pour les cellules saines qui comportent des récepteurs CD4. Puis elles fusionnent en formant des cellules géantes à plusieurs noyaux nommées syncitia.(135)

I.2.3 Dendrimères et chimiothérapie du VIH-1

Pour empêcher l’infection par le VIH il est nécessaire de bloquer au moins une de ces étapes. Les premiers antirétroviraux développés ont eu pour cibles la transcriptase inverse et la protéase.(22) Ces médicaments ont été employés en monothérapie (un seul principe actif). Malheureusement, ce traitement a provoqué l’apparition de résistances du virus aux principes actifs et (23) a été remplacé par des polythérapies (HAART, Highly Active Antiretroviral Treatment) qui consistent en l’administration de plusieurs principes actifs appartenant à plusieurs classes d’antirétroviraux.

A ce jour, la polythérapie est la meilleure méthode pour lutter contre le VIH. Cette stratégie a permis de diminuer le nombre de morts causés par le VIH et d’augmenter l’espérance de vie des personnes infectées.(24)

Par contre, de nombreux inconvénients sont associés à cette thérapie : les traitements sont sévères et toxiques, d’importants effets secondaires apparaissent et la résistance du virus aux médicaments augmente à cause de l’élimination incomplète du VIH.(25) C’est pourquoi d'autres cibles thérapeutiques sont aujourd’hui à l’étude comme les inhibiteurs d’entrée, les inhibiteurs de fusion et même les inhibiteurs de maturation.

Nous allons maintenant présenter une mise au point bibliographique sur le rôle des dendrimères pour les thérapies anti-VIH et sur quelques principes actifs utilisés actuellement en polythérapie. Ces composés seront présentés en suivant chaque étape du cycle de réplication du VIH.

Quelques paramètres biologiques sont nécessaires pour caractériser l’activité antivirale in vitro : - CI , concentration inhibitrice à 50% est la concentration minimale en composé

- RCI50, concentration inhibitrice normalisée est la concentration inhibitrice minimale

en composé multivalent nécessaire pour inhiber 50% de l’activité d’un marqueur viral multipliée par le nombre de sites actifs de ce composé, N. RCI50 = N x CI50.

- CC50, concentration cytotoxique à 50% est la concentration létale en composé pour

50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est élevée, moins le composé est toxique. - IT, indice thérapeutique est le rapport entre la toxicité et l’activité inhibitrice (CC₅₀/CI₅₀). Plus la valeur d’IT est élevée, plus le produit est efficace et sélectif.

I.2.3.1 Le dendrimère : définition et structure

Les dendrimères sont des macromolécules à caractéristiques structurelles et topologiques uniques,(26, 27) avec une architecture tridimensionnelle multibranchée, parfaitement définie et une fonctionnalité élevée.

Les six paramètres structuraux qui caractérisent la structure dendritique sont (Figure I.8) : le cœur, les motifs connecteurs, les points de divergence, la génération, les groupes terminaux et la périphérie.

Le cœur est le point focal des motifs connecteurs. Des points de divergence sont associés à chaque couche pour incrémenter la génération du dendrimère. Le nombre de groupes terminaux localisés à la périphérie du dendrimère dépend de la multivalence du cœur et des points de divergence (nommés respectivement N_c et N_d). Il dépend aussi du nombre de génération (G) et est égal à N_cN_dG. La périphérie est l’espace entre le dernier point de divergence et la surface.

Coeur

Motif connecteur Point de divergence Fonction de surface Génération ou couche

Par ailleurs, on peut trouver trois parties topologiques d’intérêt :

(1) Un cœur central, constitué par des atomes, des petites ou même de grandes molécules organiques (macrocycles) et d’intérêt biologique (carbohydrates, acides aminés et nucléotides). Il possède des propriétés particulières car il est entouré d’un environnement formé par des branches dendritiques.

(2) Le squelette, comprenant plusieurs générations ou couches intérieures composées par la répétition des unités pouvant fournir un espace flexible avec des cavités, ce qui permet d’encapsuler des molécules hôtes de taille raisonnable.

(3) La surface multivalente qui peut contenir un grand nombre de fonctions capables d’interagir avec l’environnement externe. Elles définissent souvent les propriétés macroscopiques du dendrimère.(28)

La nature originale des dendrimères n’est pas seulement due à leur morphologie. À hautes générations, l’encombrement stérique des branches à la surface des molécules dendritiques leur permet d’adopter des conformations globulaires.(29, 30) Les extrémités des branches peuvent s’allonger vers la surface ou se replier à l’intérieur. Ces arrangements sont souvent déterminés par plusieurs facteurs comme la nature du solvant ou la constitution du dendrimère. Quand les extrémités des branches sont placées sur la surface du dendrimère, les modèles moléculaires montrent que le dendrimère contient des cavités et des chenaux.(31, 32)_{Malgré la nature dynamique de ces cavités, elles}

ont un microenvironnement qui leur permet d’être utilisées pour l’encapsulation de molécules hôtes.(33)

La première synthèse de dendrimères a été réalisée par Vögtle et al.(34-37)_{à la fin des années 1970.}

En 1993, Mülhaupt et al.(36)

et Meijer et al.(37)

ont poursuivi simultanément les travaux commencés par Vögtle, et ont décrit la préparation des dendrimères poly(propylèneimine) (PPI) à cœur diaminobutane (aussi nommés dendrimères DAB).(38)

En 1981, Denkewalter et al. ont synthétisé des composés macromoléculaires formés par des unités de lysine sur au moins quatre couches successives. Plus tard, ils seront nommés dendrimères poly-L-lysine.(39)

Le groupe de Tomalia(26, 40-43)_{a décrit une voie synthétique afin d’obtenir des macromolécules}

polyamidoamine (PAMAM) branchées en forme d’étoile, aussi appelées dendrimères starburst. Tomalia est le premier à employer le terme « dendrimère » qui vient du mot grec dendros = arbre et qui est aujourd’hui universellement utilisé pour décrire les composés macromoléculaires monodisperses hautement hyperbranchés.

de carbone tétraédriques comme le pentaérythritol pour obtenir des structures compactes de type « arborol » (arbor = branche). Ces molécules ont été fonctionnalisées avec des groupes hydroxyles à la surface.

On peut également citer deux avancées importantes : en 1990, Fréchet et al. ont introduit un nouveau type de dendrimère avec un squelette polyéther.(44)_{Puis en 1994, Caminade et Majoral ont}

été les premiers à concevoir la synthèse de dendrimères phosphorés neutres.(45)

I.2.3.2 Interaction des dendrimères avec les systèmes biologiques

I.2.3.2.1 Le concept de multivalence

Dans la nature, la plupart des processus de reconnaissance entre systèmes naturels sont multivalents.(46) Par exemple, des anticorps bivalents s’attachent spécifiquement aux antigènes. De même, le virus influenza adhère aux cellules hôtes pour les infecter par des interactions multivalentes entre l’hémagglutinine trimérique virale et les résidus carbohydrates avec des fonctions acide sialique dans la surface de la cellule hôte.(46)

Dans le document Dendrimères phosphorés catanioniques inhibiteurs du VIH : propriétés physico-chimiques et activité antivirale (Page 33-47)