Effet de l’acide usnique sur la croissance bactérienne et le métabolisme 1. Personnages mis en scène

L’acide usnique, composé lichénique produit par le partenaire fongique, est présent dans de nombreux lichens. Des études ont mis en évidence son activité antibiotique envers les bactéries Gram-positif [4]. Il est donc intéressant dans le contexte de la relation bactérie-lichen d’observer l’effet de ce composé sur diverses souches. Pour cette étude nous avons sélectionné une souche Gram-négatif, la souche

MOLA 1416 dont le profil chimique a été étudié lors des travaux de thèse de Delphine Parrot. Deux

souches Gram-positif ont également été choisies : la souche DP94 précédemment étudiée et MOLA

1488, préalablement étudiée par D. Parrot et qui a la particularité de produire de l’acide usnique.

a. Souche DP94

Cette souche a déjà été décrite dans le chapitre 1, c’est une Actinobactérie Gram-positif isolée à partir du lichen Collema auriforme. Elle appartient au genre Nocardia et possède 100 % de similarité par l’analyse de l’ARNr 16S avec les espèces N. soli, N. cummidelens et N. salmonicida.

b. Souche MOLA 1416

La souche MOLA1416 a été isolée à partir du lichen Lichina pygmaea, récolté en bord de mer à la pointe de la Houssay en Bretagne par Delphine Parrot et Sophie Tomasi. Le lichen a été rincé sur le terrain à l’eau stérile, puis il a été lavé à plusieurs reprises par de l’eau de mer stérile. Ce procédé permet l’obtention d’une première série de bactéries que l’on pourrait caractériser de bactéries épilichéniques. Puis le lichen a été broyé et associé à de l’eau de mer stérile (homogénat) donnant ainsi une nouvelle série de bactéries assimilées comme étant les bactéries endolichéniques. Ces solutions ont ensuite été ensemencées sur deux milieux supplémentés en acide nalidixique et amphotéricine B : MA (Marine Agar) et AIA (Actinomycetes Isolation Agar) en boite de Pétri et des repiquages ont été effectués jusqu’à l’obtention de colonies pures. Ainsi, la souche MOLA1416 a été obtenue à partir de l’homogénat (bactérie endolichénique). Elle a ensuite été séquencée et identifiée en 2013 par analyse du gène de l’ARNr 16S par comparaison avec les souches référencées dans la base de données EzTaxon server, comme étant Hoeflea phototrophica avec 91,9 % de similarité. Puis elle a été de nouveau identifiée en 2017 par Laurent Intertaglia, responsable de la souchothèque de l’observatoire océanologique de Banyuls-sur-mer, et la souche MOLA1416 a présenté 93,6 % d’identité avec Chelativorans intermedius et Mycoplana ramosa.

Figure 101 : Isolement de la souche MOLA1416 à partir du lichen Lichina pygmaea

C’est une bactérie Gram négatif et ses colonies sont petites, lisses et colorées en rouge. Le pigment responsable de cette coloration a été isolé et identifié comme étant la de 6-méthoxy,2-méthyl,3-heptylprodiginine (Figure 102). L’étude chimique de cette souche bactérienne a également permis l’isolement de la cyclo (L-Leu-L-Pro) et une analyse du profil chimique par réseaux moléculaires a mis en évidence 25 composés appartenant à diverses familles : des dicétopipérazines, des dérivés polyphénoliques (isoflavones, isocoumarines), des glucocorticoïdes, un stérol, un alcaloïde et un dérivé d’acide aminé [230].

Figure 102 : Composés isolés à partir de culture de la souche MOLA1416

c. Souche MOLA1488

La souche MOLA1488 a été isolée à partir du lichen Lichina confinis lors des travaux de thèse de

Delphine Parrot. Le lichen a été récolté au même endroit que Lichina pygmaea et l’isolement des

souches bactériennes a été réalisé selon le même protocole que pour la souche MOLA1416. L’identification de la souche réalisée par analyse de l’ARNr 16S et comparaison au serveur EzTaxon a donné 100 % de similarité avec l’espèce Streptomyces cyaneofuscatus.

Cette bactérie est Gram-positif et ces colonies sont convexes, irrégulières et de couleur orangée. Elle produit un filament mycélien aérien blanc. L’étude du profil chimique de la culture de cette souche en milieu liquide a mis en évidence la production d’acide usnique, ainsi que de cyaneodimycine, de cyaneomycine, de (3-hydroxyacétyl)indole, de N-acétyl--oxotryptamine de N-méthyldactinomycine et de deux dicétopipérazines : la cyclo-(L-Phe-L-Pro) et la cyclo- (L-Leu-L-Pro) (Figure 104) [231].

Figure 104 : Composés isolés à partir de culture de la souche MOLA1488

2. Effets de l’acide usnique

a. Effets sur la croissance bactérienne

Dans le cadre d’un stage de l’UE recherche, Mélanie Clément a réalisé ces travaux. L’étude a été réalisée sur 30 mL de milieu de culture ensemencés par chacune des trois souches. L’acide usnique dissous dans le DMSO y a été ajouté à une concentration de 0,1 mg/mL dès le début de la période d’incubation. Des témoins de culture des bactéries seules et des bactéries en présence de DMSO ont été ensemencés en même temps pour observer un éventuel effet du DMSO sur la croissance ou le métabolisme. Chaque échantillon a été réalisé en duplicata. La croissance bactérienne a été mesurée quotidiennement jusqu’à 7 jours après le début de la phase stationnaire, par mesure de la densité optique à 620 nm et par test au MTT mesurant la viabilité cellulaire. Pour l’analyse de l’effet de l’acide usnique sur le métabolisme bactérien, les cultures ont été arrêtées soit au début de la phase stationnaire soit après une semaine de phase stationnaire. Les échantillons ont alors été analysés par HPLC/MS pour comparaison des profils chimiques (Figure 105).

Figure 105 : Schéma récapitulatif de l’étude de l’effet de l’acide usnique sur les bactéries associées aux lichens

Dans le cas de la souche MOLA1416 on constate que l’ajout d’acide usnique (ou de DMSO) dans le milieu de culture n’a pas d’incidence sur la croissance de cette bactérie. Un simple retard de croissance peut être détecté au début de la courbe. Dans le groupe des témoins bactéries seules ou bactéries + DMSO, la phase de croissance exponentielle débute dès le deuxième jour de culture alors qu’en présence d’acide usnique elle ne débute qu’après le troisième jour de culture (Figure 106).

Les souches DP94 et MOLA1488, quant à elles, sont fortement inhibées par l’acide usnique, aucune croissance n’est observée (Figures 107 et 108).

Ces résultats sont confirmés par le pourcentage de viabilité mesuré à l’aide du test au MTT en comparaison avec les témoins.

Figure 106 : A) Comparaison des courbes de croissance des échantillons de MOLA1416 en fonction du temps, B) Pourcentage

Figure 107 : A) Comparaison des courbes de croissance des échantillons de DP94 en fonction du temps, B) Pourcentage de

viabilité de la souche DP94 en présence d’acide usnique (AU) mesuré par test au MTT

Figure 108 : A) Comparaison des courbes de croissance des échantillons de DP94 en fonction du temps, B) Pourcentage de

viabilité de la souche DP94 en présence d’acide usnique (AU) mesuré par test au MTT

L’acide usnique est un composé connu pour ses propriétés antibiotiques contre les bactéries à Gram-positif et anaérobies [232,233]. Les résultats obtenus lors de ces travaux correspondent avec ce qui a été préalablement décrit pour l’acide usnique. Il n’a pas d’activité antibiotique sur la souche

MOLA1416 qui est une bactérie Gram-négatif et il inhibe la croissance des souches MOLA1488 et DP94

qui sont des bactéries Gram-positif.

Il est à noter que la souche productrice d’acide usnique, MOLA1488, est elle-même inhibée par ce composé. On peut supposer qu’elle produit ce métabolite en faible quantité dans un but d’autorégulation de sa prolifération.

Lorsque les cultures ont atteint le début de la phase stationnaire, un premier lot a été arrêté, le deuxième lot étant arrêté après 7 jours de phase stationnaire (Figure 109). Après extraction à l’acétate d’éthyle, les extraits ont été analysés par HPLC/MS pour observer l’effet de l’acide usnique sur la production bactérienne.

Figure 109 : Courbe de croissance bactérienne

La comparaison des chromatogrammes HPLC des extraits issus de la culture de la souche MOLA1416 en présence d’acide usnique avec ceux des témoins (Figure 110) montrent dans le premier lot une différence de production bactérienne en présence de DMSO. Dans le deuxième lot, on constate que la production des échantillons témoins a évolué avec le temps, le chromatogramme obtenu est maintenant comparable à celui des échantillons en présence de DMSO. La présence de DMSO accélère le métabolisme bactérien. Nous observons également que l’acide usnique induit la production de nouveaux composés apparaissant dans la zone des temps de rétention autour de 33 min.

Figure 110 : Comparaison des profils chimiques de MOLA1416, A) au début de la phase stationnaire, B) à la fin de la phase stationnaire. HPLC/UV-DAD sur colonne Prevail® C18 5 µm, gradient d’élution H2O/ACN : 100% H2O de 0 à 5 min, de 0% à 100% d’ACN entre 5 et 35 min, 100% d’ACN de 35 à 45 min, de 100% à 0% d’ACN entre 45 et 50 min, 100% d’H2O de 50 à 60 min. Détection par UV-DAD (détecteur ultra-violet à barrette de diode) ici montrée à 220 nm

L’analyse par spectrométrie de masse en mode positif du composé éluant à 32,2 min sur le chromatogramme montre un ion majoritaire avec une masse de m/z 388. Son spectre UV présente une longueur d’onde maximale d’absorption à max = 289 nm proche de celle de l’acide usnique (281 nm) laissant supposer que nous sommes en présence d’un dérivé de l’acide usnique. Ce composé sera décrit dans la partie suivante. L’acide usnique est toujours présent sur les chromatogrammes après une semaine de phase stationnaire, il n’est donc pas totalement métabolisé par la souche MOLA1416.

b-2. Résultats pour la souche DP94

L’analyse des chromatogrammes obtenus avec les extraits de DP94 ne montrent aucune influence de l’acide usnique sur la production bactérienne. L’acide usnique n’apparait pas sur ces chromatogrammes, il a complètement précipité dans le milieu de culture et il est resté avec le culot bactérien lors de la centrifugation des échantillons (Figure 111).

Figure 111 : Comparaison des profils chimiques de DP94, A) au début de la phase stationnaire, B) à la fin de la phase stationnaire. HPLC/UV-DAD sur colonne Prevail® C18 5 µm, gradient d’élution H2O/ACN : 100% H2O de 0 à 5 min, de 0% à 100% d’ACN entre 5 et 35 min, 100% d’ACN de 35 à 45 min, de 100% à 0% d’ACN entre 45 et 50 min, 100% d’H2O de 50 à 60 min. Détection par UV-DAD (détecteur ultra-violet à barrette de diode) ici montrée à 220 nm

MOLA1416 MOLA1416 + DMSO MOLA1416 + DMSO + AU A) _B) Acide usnique DP94 DP94 + DMSO DP94 + DMSO + AU A) _B)

L’analyse des chromatogrammes obtenus avec la souche MOLA1488 fournit de nombreuses informations. Tout d’abord, l’acide usnique est toujours présent au début et à la fin de la phase stationnaire de croissance de cette souche. Ensuite nous observons que l’ajout de DMSO dans le milieu provoque l’apparition d’un composé avec un temps de rétention de 22,8 min. Dès le début de la phase stationnaire, la présence d’acide usnique induit l’apparition de nouveaux composés avec notamment des composés très polaires éluant en tout début de gradient à 13,3 et 13,5 min. Deux autres composés nouveaux sont détectés en fin de gradient à 26,4 min et 31,6 min (Figure 112).

Figure 112 : Comparaison des profils chimiques de MOLA1488, au début de la phase stationnaire. HPLC/UV-DAD sur colonne

Prevail® C18 5 µm, gradient d’élution H2O/ACN : 100% H2O de 0 à 5 min, de 0% à 100% d’ACN entre 5 et 35 min, 100% d’ACN de 35 à 45 min, de 100% à 0% d’ACN entre 45 et 50 min, 100% d’H2O de 50 à 60 min. Détection par UV-DAD (détecteur ultra-violet à barrette de diode) ici montrée à 220 nm

L’analyse en spectrométrie de masse en mode positif des composés en début de gradient montrent un pic pseudomoléculaire avec un m/z de 268 (Figure 113). Le spectre UV présente une longueur d’onde maximale d’absorption à 255 nm. Si l’on considère que ce composé est un métabolite de l’acide usnique, alors le déplacement hypsochrome sur le spectre UV et la perte de masse importante par rapport à l’acide usnique (- 77) témoignent d’un clivage de la molécule au niveau du chromophore. Cependant ce composé est retrouvé dans tous les chromatogrammes obtenus avec la souche DP94 (avec ou sans acide usnique) ce qui ne corrobore pas la théorie du métabolite de l’acide usnique. Cela peut être un composé dont la production est induite par l’acide usnique, ou un composé libéré lors de

Acide usnique Composés inhibés Composés avec production stimulée MOLA1488 MOLA1488 + DMSO MOLA1488 + DMSO + AU

la cytolyse des bactéries inhibées par ce composé. En effet, rappelons-le, la croissance de cette souche est totalement inhibée par l’acide usnique.

Figure 113 : Spectre de masse en mode positif du pic de Tr=13,3 min de MOLA 1488 en présence d’acide usnique

Les deux autres composés éluant à 26,4 et 31,6 min donnent respectivement en spectrométrie de masse des ions à m/z 333 et m/z 359 en mode négatif. Ces composés dérivent potentiellement de l’acide usnique mais aucune hypothèse valable de structure n’a pu être proposée.

D’autres composés initialement produits par la souche MOLA1488 voient leur production inhibée en présence d’acide usnique. C’est notamment le cas pour le composé majoritaire éluant à 20,8 min, qui a été identifié lors des travaux de thèse de Delphine Parrot comme étant la cyclo (L-Leu-L-Pro), sa production est totalement inhibée par l’acide usnique. Nous avons précédemment démontré que la croissance de cette souche était inhibée par l’acide usnique et il est établit que les dicétopipérazines servent de molécule signal entre les bactéries dans le cadre du quorum sensing. Etant donné que la densité bactérienne est faible il n’est pas étonnant que ces molécules ne soient presque plus excrétées. On peut également émettre l’hypothèse que, la souche étant en danger à cause d’un composé toxique, elle réalise une économie de ses ressources en limitant les fonctions non vitales.

A la fin de la phase stationnaire on retrouve un profil chimique similaire (Figure 114). Les composés élués au début du gradient sont toujours produits en présence d’acide usnique et on constate la même inhibition des composés entourés en bleu. Cependant les signaux précédemment détectés à 26,4 et 31,6 min ne sont plus présents sur le chromatogramme. L’acide usnique est, quant à lui, toujours présent sur le chromatogramme, témoignant du fait qu’il n’est pas totalement métabolisé par la souche MOLA1488.